Varför har PCR produkters 5' ände ingen fosfatgrupp?
.
Den första basen i ditt PCR amplifierade DNA (eller produkten) kommer att vara den första basen från din primer.
Så om du har en fosfatgrupp på produkten beror på om du beställer dina primrar med eller utan fosfat-grupp på 5'-positionen.
Saknar dina primers en fosfatgrupp kan du antingen behandla dem innan PCR reaktionen med T4 Polynucleotide Kinase som överför en fosfatgrupp till 5'-ribosen från ATP, om du behöver en 5'-fosfat. Annars kan du välja en kloninsstrategi som inte är beroende av 5'-fosfatgruppen (t.ex. ligation independet cloning (LIC) i princip samma som Gibson assembly, vilka utesluter det enzymatiska ligeringssteget innan transformering).
5'-fosfatgruppen är av störst vikt vid blunt end ligering, för har du överlappande komplementära delar vid ändarna (over-hangs på kloningsengelska) kan transformeringen bli framgångsrik även med icke-linjeriserat DNA, med s.k. nicks. Då kommer DNA reparationsenzymerna i t.ex. E. coli bygga ihop vektorn. Dock minskar effektiviteten, så mer PCR produkt eller mer kloningskompetenta celler behövs.
Vid blunt end ligation kan PCR produktens 5´-fosfatgrupp tillsammans med en defosorylerad vektor minska mängden själv-ligering av vektorn, och på så vis minska bakgrunden av självligerad vektor utan insert.
