Testa proteins värmestabilitet med CD-spektroskopi
Hej, när man gör en sån analys, är det CD-spektrofotometern själv som ändrar temperaturen på provet och mäter medan?
Ja, hela kyvetten med provet i värms upp inuti en isolerad enhet av CD-instrumentet. Resterande del av CD-instrumentet hålls vid en konstant temperatur, slangar, elektronik, utsidan kan inte gärna värmas upp till 100°C.
Okej!
Om vi låtsas som att den inte hade den funktionen, skulle det vara likvärdigt att vi själva värmer provet till de önskade temperaturerna och analyserar sedan? Om provet hinner svalna innan analysen så blir resultaten inte samma va?
Förändringen av strukturen är ju i detta fall beroende av temperaturen, och en värmeinducerad effekt (t.ex. partiell denaturering) kan mycket väl minska eller försvinna helt när materialet svalnar (i exemplet kan proteinet veckas igen, och effekten kan inte observeras).
En faktisk minskningar i intensiteten för t.ex alfa-helix som en konsekvens av upphettning kan återfå ursprungsintensiteten efter avsvalnande.
Värms proteinet för mycket och börjar denaturera icke-reversibelt kommer den denaturerade fraktionen av totalmängden aggregera istället för att vecka sig tillbaka till ursprungsstadiet.
Okej!
Du sa upp till 100 grader? På exempelgrafer vår lärare visade testade han alltid upp till 50, vad för tillämpningar är det intressant med upp till 100 grader?
Om man vill undersöka köldstabilitet kan man väl också göra det?
Temperaturintervallet du mäter beror på proteinets egenskaper, vad du vill studer och vilken typ av instrument du har tillgång till. Är det t.ex. ett protein från E. coli eller Saccharomyces kan 50°C räcka, för rekombinanta versioner av våra proteiner så räcker det garanterat.
Men vid 100°C klarar sig termofiler och deras proteiner galant (t.ex. DNA polymerasen som används vid PCR, de klarar DNA denatureringsstegen tillsammans upp till en timme utan problem vid <95°C). Kan inte CD-instrumentet nå så höga temperaturer kan några molar urea tillstättas, och då förskjuts värmedenatureringen av proteinet till ett lägre temperaturintervall.
Köldstabiliteten går också att mäta, ner mot noll, och under med rätt kryo. Dock är ofta temperaturintervallet mellan 4 och 0 grader, lika illa omtyckt av proteiner som från 0 till några minusgrader. Ishinken är sällan bättre förvaringsplats för proteiner jämfört med kylskåpet.
Okej!
Tack så mycket, jag har inga fler följdfrågor
