Rena ett endogent omodifierat enzym
Jag har ett enzym som är endogent och omodifierat i en bakterie med mycket motståndskraftiga väggar.
Vilka reningssteg bör jag hålla mig till, säg 3 stycken, för att hålla utbytet så högt som möjligt?
Start i extraktion, bakterien har väldigt tjocka cellväggar, vad är då lämpligt?
Steg 1. Homogenisering och sen centrifugering för att fraktionera ut enzymet.
Steg 2. Saltutfällning.
Steg 3. Någon typ av kromatografi?
Hur testar jag utbytet mellan reningsstegen? Jag tänker att jag kan spara prover efter varje steg och sedan göra en SDS-page men även mäta absorbansen?
Någon som kan göra en input, låter detta som ett rimligt protokoll för enzymrening? Och pga att enzymet är endogent och omodifierat, krävs det någon extra tanke där kring valen?
Tack på förhand!
En bra början. Lite frågor att fundera över:
Extraktionen: cellväggen är motståndskraftig, vad består den av och hur hål göras eller till och med bryta ner cellväggen? Detta sker ju i naturen så hur sker det där?
Hur kan cellväggen annars skadas så pass mycket att ditt eftersökta enzym läcker ut, kanske mekaniskt?
Steg 1: Centrifugering för att fraktionera enzymet från andra partiklar är speciellt användbart för membranproteiner, då cellmembranen och dess proteiner kan isoleras med ultracentrifugering. Dock misstänker jag att ditt eftersökta enzym finns lösligt i cellens cytoplasma, då är inte centrifugering endast användbart om det är stort (typ ribozym), då det är komplicerat och tidskrävande att separera lösliga proteiner/enzymer med t.ex. sukrosgradientcentrifugering.
enklare att gå direkt till ditt steg2
Steg2: saltutfällning är utmärkt val och kan enkelt separera ditt protein från merparten av de andra endogena proteinerna, kan till och med bli mer än 90% rent i ett enda steg.
Steg3: kromatografi vore bra att få ett renare enzym. Vilka typer av kromatografi kan du tänka dig? Vilka egenskaper separeras proteinerna efter vid ditt/dina valda kromatografisteg? Kanske du behöver använda mer än en typ av kromatografi?
Utbytet: är det enzym kanske du kan följa dess enzymatiska aktivitet? Substratförbrukningen eller produktbildningen kanske kan följas med en spektrofotometer? Det är nog den mest känsliga viset att bestämma den relativa aktiviteten om du samtidigt jämför med den totala proteinkoncentrationen. SDS-PAGE går också att bestämma koncentrationen från. Fram för allt går det att uppskatta hur pass rent proteinet är.
Din sista fråga, något extra att tänka på - vad tror du själv är skillnaden mot att rena fram ett protein med en affinitetstag (t.ex. his- eller FLAG- tag)? Går det inte att se enzymaktiviteten kanske något annat krävs för att verifiera att du renat fram "rätt" protein?
