Proteinrening(analytisk kemi)
Bakgrund: jag ska rena fram enzymet tentas med först jonbyteskromatografi och sedan affinitetskromatografi. Efter att man kört på de två kolonnerna vill man fastställa var tentaset finns bland de olika fraktionerna. Det finns tillgång till en antikropp mot tentaset i kanin.
a) Beskriv hur du kan bestämma vilka fraktioner som innehåller ditt protein genom direkt analys.
b) Du genomför direkt analys men blir inte nöjd med det svaga resultatet, och vill göra om analysen för att få en starkare signal. Du har tillgång till en biotintaggad antikropp mot kanin antikropp. Beskriv hur du kan göra.
Hur jag tänker på a) Eftersom att jag har tillgång till en antikropp mot tentas och det handlar om direkt analys så kanske det kan vara dot blot som är mest passade för att välja fraktion. Är inte säker om det stämmer och behöver därför lite hälp.
b) Här förstår jag inte riktigt vad de är ute efter i frågan. Biotintaggad antikropp kommer göra signalen stakare. Är det fortfarande Dot blot som är det optimala om man fått en svag signal?
Tacksam för hjälp
Hur använder dina lärare begreppet "direkt analys"?
Mina kunskaper kanske är lite rostiga, men jag uppfattar "direkt analys" som något man gör när man har en antikropp som är kopplad till en fluorofor, så att man kan få fluorescens direkt från antikroppen. Men det står ingenstans i din uppgift att antikroppen fluorescerar. Är det kanske underförstått, eller använder dina lärare begreppet direkt analys på något annat sätt än jag förstått det?
På b känns det upplagt för Western blot. Du har en primär mot tentas och en sekundär antikropp mot kanin-IgG. Det kan du använda till Western (men i princip även till en dot blot).
Det anges inte hur du kan detektera antikroppen, men det borde finnas något konjugerat (kopplat till) den primära antikroppen som kan ge en signal, t.ex. en florofor eller något som ger signal från et substrat (HRP eller dyligt).
för a) kan du använda tentas-antikroppen som primär antikropp. Om denna är konjugerad med något som ger dig en avläsbar signal, t.ex. en florofor eller HPR, kan denna användas för att detektera var antikroppen och ditt tentas är. Western/dot-blott funkar bra.
för b) under antagandet att den primära antikroppen kan detekteras, så använder du den primära antikroppen mot tentas, sedan den sekundära biotin-taggade antikroppen mot den primära. Efter detta kan du använda t.ex. ELISA, där biotintaggen används för att immobilisera den sekundära antikroppen (t.ex. med en strepatavidin-märkt ELISA-platta) och därmed tentas+primärantikroppen. Detta gör att komplexet (tentas-primär-sekundär antikroppar) ackumuleras och detta ger en starkare signal. Om du anger att din tentas-antikropp är konjugerad med en florofor kan en ännu högre signal fås i ELISA detektorn.
