PGLO transformation vad fyller agarplattorna för funktion?

Du har inte riktigt beskrivit experimentet.

Det verkar som en transformation av E. coli med pGLO-plasmiden. pGLO plasmiden har en arabinos-inducerbar promotor, som kontrollerar transkriptionen av mRNA för GFP.

Selektion för bakterier som har tagit upp plasmiden gör du genom ampicillin, då plasmiden ger resistens (bakterierna bryter ner antibiotikan och överlever) kommer de bakterier som inte har plasmiden att dö eller inte växa i alla fall.

Exakt, det är det vi har gjort, överföring av pGLO till E.Coli mha heatshocking och CaCL2, därefter har vi lätt vi de växa under 48 timmar period. Ja, det finns en Bla region (kallas de regioner?) som kodar för amipicilin resistens, sedan arac som är en promotr region för GTP utryckning. Tror jag förstår det där med grupp 4 att den indentfierar att genen tagit upp på grund av antiobiotika resistens, men förstår inte riktgit varför man behöver använda sig av de andra agarplattorna och vad de hjälper oss identfierar. 

Stegen vid experimentet är anpassade för att få ett önskat resultat, i ditt fall är det nog E. coli kolonier på en platta som fluorescerar grönt om de belyses med t.ex. Uv-ljus (ser även gröna ut i vanligt ljus, i jämförelse med E. coli utan proteinet GFP).

Men, för att kunna se att de ingående materialen/faktorerna (t.ex. bakterierna, antibiotikaselektionen, induktionen med arabinos) beter sig som väntat används kontroller.

De fyra plattorna har varsin egen kombination av material/faktorer - och utifrån hur resultatet blir (kolonier på plattan, +/- grön färg) kan eventuella avvikelser ses.

Om t.ex. bakterierna redan hade plasmiden pGLO skulle det även finnas kolonier på plattan 2.

Hur såg ditt resultat ut förresten? Var fanns kolonier och vilka färger hade kolonierna på de olika plattorna?

platta 4 gröna fluroceand

platta 3 vita kolonier

platta 2 inga kolonier

platta 1 några få vita kolonier 

men hu r funerar platta 1 som kontroll? för vad?

Hur stämmer det med vad du kunde förväntat dig?

Fundera efter vad de olika kombinationerna kan ge.

Faktor => effekt av faktorn

t.ex. nummer 4 med:

E. coli   => E. coli kolonier om de kan överleva på bara LB plattan.

pGLO =>  ampecillin resistens, kan få transformerade cellerna att överleva  och bilda kolonier i närvaro av Amp (men inget GFP utan ara)

Amp  => antibiotika som dödar vanliga icke-resistenta E. coli celler.

ara  => inducerar produktionen av mRNA kodande för GFP, som ger GFP proteinet i bakterierna. Ger grönfärgade kolonier.

Denna kombination av kontroller 1-4, ger en bra uppfattning över om varje faktor faktiskt fungerar.

För om du bara haft en platta t.ex. nummer 4, och den inte skulle ha några kolonier, eller inte några gröna kolonier - då hade det varit svårt att lista ut vilken del av materialet som inte fungerat väl, eller om det var något som gått snett.

ok jag ska funderar på detta lite i eftermiddag. Återkommer förhoppningsvis med ett vettigt resonemang. 

Okej, kör ett tolkning försök av vad de olika plattorna kan bekräfta, gör jag fel någonstans? 

4. Amp och ara är närvarande. Arabinos behövs för att Arac skall bli av med sin repressor bundet till promotor regionen av hela operonet. Då ara är närvarande kan man bekräfta att genen som man eftertraktar har förts in i plastiken. Amp bekräftar också att cellen innehåller plasmiden. Ifall plasmiden inte hade förts in men genen inte var närvarande skulle den inte flurocera grönt. 

3. Används för att indetifera att det är just GTP genen som ger det flurocerande och i att det inte är någon annan gen som utrycker detta. AMP bekräftar att plasmiden förts in i baktrien. 

2. Den här är jag inte säker på. Men jag tror att AMP bekräftar att bakterien inte är antibiotika resistant från första början och att det är just plasmiden som har infört och inte någon annan faktor. Om bakterierna inte dött här vet man säkert att antibiotika resistans kanske redan finns i bakterier och att arabinos kanske påverkade någon annan plasmid. 

1. Man använder detta för att bekräfta att bakterien i huvudtaget kan växa i detta medium. Ifall bakterierna skulle dött här innebär det att det är något fel i växt mediumet.

Jag är mest osäker på 2 och 1 vad konsekvenserna blir av misslyckade resultat. 

4. Denna del av experimentet är oftast målet med hela experimentet, att i E. coli (eller annan organism) producera ett protein, som sedan kan studeras vidare eller renas fram och t.o.m. användas som läkemedel. De andra plattorna är kontroller för att se så att inget annat sker, och om det inte bildas något protein kan de andra plattorna hjälpa till att med uteslutningsmetoden ta reda på vilket steg som inte fungerat.

Så främst är denna platta för att se så att GFP bildas. Och detta som du skrev, genom att arabinoset tar bort repressorn. Repressorn kontrollerar om genen skall uttryckas och mRNA för GFP skall bildas. Det blir antingen eller för GFP, och om cellerna är gröna är allt bra. Men är inte cellerna gröna kan det t.ex. vara ett problem med plasmiden (felklonat så inget funktionellt mRNA kan bildas, är nog vanligast).

3. Nej inte riktigt GFP, utan för att se att plasmiden tagits upp av bakterierna. Och för att jämföra med plattorna 1 och 2. Har ingen plasmid tagits upp växer inte cellerna. Växer cellerna på denna platta men inte på 2, så verkar transformeringen gått bra och selektionen även den. Bildas inget GFP på 4 men 3 ser bra ut, är det nog något problem med kloningen av genen som kodar för GFP, o.s.v.

2. Ja, denna kontroll är för om se att antibiotikan kan ge den selektion du behöver, d.v.s. att verifiera att endast de celler som tagit upp din pGLO plasmid växer. Är dina bakterier kontaminerade med en annan plasmid med ampicllinresistens växer dessa glatt på denna platta.

Ampicillinresistensen fås genom att bakterien bildar ett enzymet som bryter ned ampicillin (ett beta-laktamas), men den genen i plasmiden transkriberas hela tiden under en annan promotor än den som aktiveras av arabinos. Beta-laktamaset bildas hela tiden och GFP bildas bara när arabinosen tar bort repressionen av denna promotor (typ tar bort bromsen).

1. Precis. Finns det mer än en typ av mikroorganismer (t.ex. om dina E. coli var kontaminerade med en annan bakterie) kanske det kan ses. Det bildas då mer än en typ av kolonier, vilka kanske kan ses på koloniernas utseende (det kan skilja mellan; form, storlek, färg, torra/slemmiga).