PCR utan DNApol eller primers?
Går det inte att bara förlita sig på random annealing och DNA ligas (om vi har ett värmetåligt DNA ligas).
Inte riktigt säker på vad vilken produkt du är ute efter? PCR bygger ju på amplifiering av templatet med DNA polymeraset.
Med enbart ligas och värme skulle du kunna kopiera templat DNA om dina primrar täcker hela templatet (och de annealar ungefär lika effektivt). Titeln exkluderar dock ligaset.
Vadå?
Jag menar att alla nukleotider binder spontant, sedan limmas det ihop med DNA ligas, då behövs inte DNApol eller primers. Jag tänkte att detta skulle funka om man inte vet om sekvensen av sitt test och kan därför inte göra primers.
Ok, så med endast dNTPs, ligas och växlande värme.
Ditt dsDNA denaturerar, och temperaturer sänks (för att möjliggöra annealing) vad tror du kommer att anneala först i blandningen, den komplementära ssDNA strängen eller de fria nukelotiderna?
För att binda in till DNA och katalysera ligeringen brukar en viss längd av komplementärt dsDNA behövas (detta beror på typ av ligas, men i detta fall verkar du vilja klona något), men med endast nukleotider hur går detta?
Bara för att du säger det så tror jag att komplementär ssDNA binder först... Men varför? Jag har ingen aning om varför.
Ja, det med att ligas inte kan ligera en sträng där alla nukleotider är obundna hade jag i tankarna. När vi stött på ligaser i kursen är det alltid bara EN nick, nu är det ju nicks mellan varje bas...
Qetsiyah skrev:Bara för att du säger det så tror jag att komplementär ssDNA binder först... Men varför? Jag har ingen aning om varför.
Det komplemetära ssDNA är ju en polymer av nukleotider, där varje nukleotid bidrar med 2-3 bindningar till bindningsenergin. Så summan av alla dessa bindningar i dsDNA...
Jämfört med de fria nukleotiderna som binder var och en för sig...
Qetsiyah skrev:
Ja, det med att ligas inte kan ligera en sträng där alla nukleotider är obundna hade jag i tankarna. När vi stött på ligaser i kursen är det alltid bara EN nick, nu är det ju nicks mellan varje bas...
Skulle ligaset kunna ligera enskilda nukleotider, så utför det ju samma DNA polymeraset.
