PCR: hur har primers nånsin en chans att binda när komplementära strängen finns hela tiden?
Hej,
Den komplementära strängen måste ju ha mycket större affinitet för att binda med templaten jämfört med primern som är mindre, så hur kan PCR ens fungera?
Är det något annat at play förutom det faktum att primers normalt har mycket högre koncentration?
En stor del av förklaringen ligger i koncentrationerna är olika, precis som du är inne på (såg precis uppdateringen du gjorde).
Ofta tillsätts primers i så pass hög koncentration att dessa går att se på en agarosgel, t.ex. när PCR reaktionen inte fungerat, så ses primrarna som ett diffusare men klart band "längst ner".
Medans templatet oftast inte syns alls, trots att varje templatmolekyl består av många fler deoxynukleotider, jämfört med primrarna.
OKej! (tur att du såg uppdateringen!)
Men har det inte något att göra med den snabba temperaturändringen och kemisk (o)jämvikt? Det nämnde en annan expert jag frågade, jag tror inte jag förstod vad han sa. Vi låter ju ändå lösningen vila vid hybridiseringstemepraturen ett tiotal sekunder, det borde vara tillräckligt för att uppnå jämvikt.
Bra fråga, temperaturändringen under annealing-steget borde påverka templatet och primern olika. Primrarnas mindre massa/storlek borde göra att de tumlar runt snabbare, oavsett temperatur. Är templatet å andra sidan stort, t.ex. kromosomalt DNA, så har det en mycket högre affinitet för den komplementära strängen, jämfört med primern. Men samtidigt borde det vara en högre risk att de längre strängarna av templat-DNA missmatchar, när de försöker anneala (ledsen för svengelskan). Blir temperaturen lägre kan de enskilda templatsträngarna även trassla ihop sig och bilda sekundärstrukturer, liknande i mRNA, vilket förhindrar korrekt annealing av hela templatsekvensen.
Oavsett hur annealingen av templatsträngarna går, så hinner primrarna, prova sig fram tills de hittar sin komplementära sekvens. Och detta motverkar också att templatsträngarna lyckas anneala. Koncentrationsskillnaden är samtigt så stor, att chansen för att templatsträngarna lyckas anneala korrekt är nog väldigt låg. Har inga koncentrationssiffor i huvudet med det är i alla fall flera tiopotenser i koncetrarionsskillnad.
För att få en schysst annealing av två komplementära DNA-strängar, kan man bara hetta upp blandningen av strängarna, motsvarande denatureringssteget under PCR typ 95C i 10 min, och sedan låta vätskan långsamt svalna i PCR apparaten, för att på så vis maximera chansen för en korrekt annealing.
Okej... Bra argument. Tack!
