PCR
Hej!
Har en PCR inlämning som jag haft tufft med att hitta svar till. Någon som förstår hur man ska tänka utifrån frågorna och bilden i dokumentet? Har svårt att läsa av DNA-fragmentet och bestämma dess storlek dessutom, förstår inte riktigt. Skulle verkligen uppskatta all hjälp som kan fås! Tack i förhand!
PCR- Inlämningsuppgift
På bilden nedan ser vi en agarosgel med visualiserade PCR produkter. Prover och kontroller är analyserade med samma primers och samma PCR reagens och har genomgått samma PCR program. PCR mixen gjordes för alla proverna tillsammans, och pipetterades sedan i separata rör för 1, 2, 3, 4, positiv och negativ. Templatet (DNA) för varje reaktion är individuellt extraherade prover och tillsatt till varje reaktion (prov 1-4 samt positiv kontroll. Till negativ kontroll har vatten använts). PCR produkten är ett fragment som antingen finns eller inte finns i provet vi undersöker.
Jämför resultaten på gelen mot de stegar som finns längst till vänster och höger. Du har uppgifter om stegarna under agarosgel-bilden.
1. Var laddas proverna på agarosgelen och i vilken riktning rör sig fragmenten? Visa i bilden och förklara hur detta kan ske.
2. Markera de två stegarna i figuren, Gelpilot 50 bp och Gelpilot 100 bp. Hur kan du veta vilken stege som sitter på vilket ställe i agarosgelen nedan?
3. Vad ser vi i brunnen för positiv kontroll (pos)? Bestäm även storlek på eventuellt fragment. Är detta ett förväntat resultat och vad brukar en positiv kontroll användas till i PCR sammanhang? Vad tyder resultatet på? Vad får det för konsekvenser för analysen?
4. Vad ser vi i brunnen för negativ kontroll (neg)? Bestäm även storlek på eventuellt fragment. Är detta ett förväntat resultat och vad brukar en negativ kontroll användas till i PCR sammanhang? Vad tyder resultatet på? Vad får det för konsekvenser för analysen?
5. Fyra olika prover är analyserade (brunn märkt 1, 2, 3 och 4). Vad visar deras resultat? Bestäm även storlek på eventuellt fragment. Är detta förväntade resultat och om inte, kan vi lita på resultaten vi ser utifrån kontrollerna?
Hej lisa_andersson1256!
Vi kan hjälpa till men först behöver du visa hur långt du kommit.
Om du gjorde laborationen vet du svaret till 1, 2.
Du har uppgifter om stegarna under agarosgel-bilden.
Så då har du en referenskörning från tillverkaren som visar hur stegen ser ut, liknande denna för en stege från en annan tillverkare:
Där är det bara att identifiera hur långt fragmenten vandrat utifrån deras respektive storlekar.
Vad tror du gäller för 3, 4, 5?
Hej!
På fråga 1 hade jag svarat att två poler kommer skapas i gelblocket där den ena vid katoden där bufferten reduceras (negativ) och den andra vid anoden där bufferten oxideras (positiv). Eftersom DNA är negativt laddat så kommer det att vilja röra sig mot den positiva anoden när batteriet startas
Ja på fråga 2 hade jag svarat att kontrollstegen längs till höger motsvarar Gelpilot 50 bp och kontrollstegen då det är bandet som vandrat längst och därmed är kortast och till vänster motsvarar kontrollstegen Gelpilot 100 bp då den är högre upp på bilden.
På fråga 3 så svarade jag att man i den positiva kontrollen inte kan se ett fragment (band). Det förväntas dock att det ska finnas ett band på grund av att primrarna ska ha bundit och dna polymeras och alla ingredienser har fungerat under pcr
Vet ej om detta jag tänkt på frågorna som jag besvarat stämmer men har ej riktigt kommit på nåt svar till fråga 4 och 5
lisa_andersson1256 skrev:Hej!
På fråga 1 hade jag svarat att två poler kommer skapas i gelblocket där den ena vid katoden där bufferten reduceras (negativ) och den andra vid anoden där bufferten oxideras (positiv). Eftersom DNA är negativt laddat så kommer det att vilja röra sig mot den positiva anoden när batteriet startas
Anoden är den negativa polen och katoden den positiva. DNA attraheras av den positiva katoden och migrerar genom gelen mot den. Strömmen brukar tillföras från en likspänningskub, då antalet volt är för högt för ett batteri (t.ex. 100V).
Så var i bilden laddades provet och åt vilken riktning migrerade det?
Ja på fråga 2 hade jag svarat att kontrollstegen längs till höger motsvarar Gelpilot 50 bp och kontrollstegen då det är bandet som vandrat längst och därmed är kortast och till vänster motsvarar kontrollstegen Gelpilot 100 bp då den är högre upp på bilden.
Men vilken som vandrat längst beror ju på åt vilket håll DNA-fragmenten migrerar, så innan du har svaren på 1 kan du ju inte veta detta...
Hur fragmenten av dessa stegar vandrar är ju lite olika, enklast är att titta på det minsta respektive det största fragmentet för respektive stege.
På fråga 3 så svarade jag att man i den positiva kontrollen inte kan se ett fragment (band). Det förväntas dock att det ska finnas ett band på grund av att primrarna ska ha bundit och dna polymeras och alla ingredienser har fungerat under pcr
Det håller jag inte med om. Det finns helt klart ett fragment så PCR reaktionen har fungerat.
Börja med att svara på 1 och sedan identifiera vad de andra banden motsvarar. Var förväntar du dig att produkten skall vara?
Vet ej om detta jag tänkt på frågorna som jag besvarat stämmer men har ej riktigt kommit på nåt svar till fråga 4 och 5
Ok börja med 1-3 först.
Tack men utifrån ditt svar på fråga 1 så är det ju katod som är den negativa polen och anod som är den positiva, det står ju överallt
lisa_andersson1256 skrev:Tack men utifrån ditt svar på fråga 1 så är det ju katod som är den negativa polen och anod som är den positiva, det står ju överallt
Stämmer, anoden är den positiva, katoden är negativ.
lisa_andersson1256 skrev:Tack men utifrån ditt svar på fråga 1 så är det ju katod som är den negativa polen och anod som är den positiva, det står ju överallt
Ja absolut, sorry!
Hur kom du vidare med svaren?
Känner helt ärligt att jag inte riktigt kommer någon vart, känns svårt
Ok på ditt foto av gelen, var laddade du provet? Om du inte minns var ser det ut som om vätska kan laddas?
En ledtråd kan vara att fyra dina stegar inte har några primrar i sig, och alla andra har primrar - så dessa är lätta att se (syns tydligt). Primrarna som är korta kommer att ha vandrat längst i gelen.
Det som är svårt är att vi inte har gjort själva laborationen på grund av de nya restriktionerna och det är därför detta blivit en inlämningsuppgift så är svårt att visualisera detta. Men om jag skulle gissa så ser det ut some det 3:e provet har laddats med vätska? Men vilken fråga utgår du ifrån så jag vet
Jag menade mer var på gelkassetten det finns plats att pipettera en vätska i. För att din PCR prov eller stege skall kunna laddas i gelen behöver det finnas ett utrymme för den vätskan, det brukar kallas en brunn. Har du inte gjort labben är det knepigare, så klart. Jag var inte medveten om att det var en teoretisk uppgift.
Om du tittar på fotot ser du konturerna av gelen. Även brunnarna framträder i överkant (lite mörkare för de är ihåliga), med lite material i vissa (ljusare p.g.a. DNA).
Primrarna är kortast och kommer att ha vandrat längst, som i 1-4, pos, neg i gelen.
Då vet du var materialet är laddat och i vilken riktning DNA har färdats.
Fråga två så kom jag fram till slutsatsen att Gelpiloten 50 bp har 9 stycken band och gelpilot 100 bp 6 stycken band på bilden så kan man se att 100 bp alltså är längs ut till höger och 50 bp är den till vänster. Stämmer detta?
lisa_andersson1256 skrev:Fråga två så kom jag fram till slutsatsen att Gelpiloten 50 bp har 9 stycken band och gelpilot 100 bp 6 stycken band på bilden så kan man se att 100 bp alltså är längs ut till höger och 50 bp är den till vänster. Stämmer detta?
Dessa två stegar finns ju med två gånger var, på respektive sida av gelen.
Och ja 100 är då längst till höger, men 50 är den näst längst till höger. Och i omvänd ordning på vänstersidan.
okej va bra att jag tolkade det rätt. Men något som jag inte riktigt förstår är då hur man ska kunna se fragmentets storlek i den positiva kontrollen? utgår man då från stegen som är 50 bp eller 100 bp? eller hur ska man kunna se det utifrån bilden
Stegen kallas så då de olika banden (eller stegpinnarna) ligger i en kolonn - titta på dit beskrivning av stegarna - varje band är ett DNA-fragment av en känd storlek. Som referens kan du titta på bilden jag lade upp av en annan stege - där är fragmentens storlekar är tydligt utmärkta.
Denna länk besvarar de flesta frågor om agaros elektrofores:
Förstår vad du menar men inte riktigt svaret på min fråga. Jag förstår att varje band av ett DNA-fragment är av en känd storlek men om vi exempelvis försöker utläsa den negativa kontrollens storlek på fragmentet så är det då 300 bp långt om vi utgår från kontrollstegen med 100 bp då antar jag? prov 1, 2 och 4 ser man ju inte är amplifierade och inga band finns vilket måste innebära att det blivit något fel? Har försöka kolla på youtube videos och alla möjliga hemsidor men förstår fortfarande ej detta
lisa_andersson1256 skrev:Förstår vad du menar men inte riktigt svaret på min fråga. Jag förstår att varje band av ett DNA-fragment är av en känd storlek men om vi exempelvis försöker utläsa den negativa kontrollens storlek på fragmentet så är det då 300 bp långt om vi utgår från kontrollstegen med 100 bp då antar jag?
Det är endast du som har denna (och den andra) stegen, så det kan vi omöjligt svara på!
Bandet i den negativa kontrollen har en längd nära ett av banden i stegen med flest band, och mellan två de två lägst banden i stegen med minst antal band (längst till höger). Jämför hur långt bandet i den negativa kontrollen migrerat, och se vilket band från någon av stegarna det motsvarar - då får du reda på hur stort DNA-fragmentet i den negativa kontrollen är.
prov 1, 2 och 4 ser man ju inte är amplifierade och inga band finns vilket måste innebära att det blivit något fel? Har försöka kolla på youtube videos och alla möjliga hemsidor men förstår fortfarande ej detta
Det ser ut som det är ett band i prov 3 eller hur?
Om jag exempelvis vill utläsa storleken för den negativa kontrollen så kan man se om man utgår från stegen på 50 bp att den borde ligga mellan 100 och 150 bp och ha en storlek på ca 135 men om man utgår från stegen på 100 bp så är den ca 150bp isåfall. Det borde väl gå att skriva så om man utgår från båda kontrollstegarna eller funkar det att exempelvis utgå från en av de bara?
lisa_andersson1256 skrev:Om jag exempelvis vill utläsa storleken för den negativa kontrollen så kan man se om man utgår från stegen på 50 bp att den borde ligga mellan 100 och 150 bp och ha en storlek på ca 135 men om man utgår från stegen på 100 bp så är den ca 150bp isåfall. Det borde väl gå att skriva så om man utgår från båda kontrollstegarna eller funkar det att exempelvis utgå från en av de bara?
Det står dig så klart fritt att använd det band du tycker stämmer bäst. Fördelen med två stegar är att upplösningen blir högre, då stegarnas fragment överlappar.
Hur ser det ut med svaren på frågorna nu då?
