När PCR inte blir som förväntat
Hej! Jag har en fråga på en uppgift som jag ej lyckas svara på, den lyder:
När man kör klassisk PCR för ett specifikt virus så förväntar man sig få ett relativt starkt band av en specifik storlek när man kör ut PCR produkten på gel ett men ibland ser gelen/PCR produkten inte ut som förväntat. Om du utgår från hur en PCR fungerar och vilka komponenter som ingår i en PCR reaktion ge två möjliga förklaringar till varför det ibland kan vara 1) inte ett band utan flera olika band av olika storlekar; 2) väldigt svagt band - ge även förslag på vad man skulle kunna ändra på i PCR.en i de respektive fallen för att få en mera optimalt fungerande PCR.
Som jag har förstått det så är primers:en den viktigaste komponenten och orsakar kanske oftast fel.
1) Beror uppkomsten av flera band att primern har bundit till fler än den önskade sekvensen av DNA? Vad kan man då ändra på för att få ett mer specifikt svar?
2) Väldigt svaga band - kan DNA:t varit dåligt eller har primern in passat in? Vad kan man ändra på här, "bättre" DNA?
Jag skulle uppskatta er hjälp mycket, tack på förhand.
I bägge fallen kan det finns mer än en förklaring. Börja med att köra PCR igen, om du bara tillsatt fel mängd(er).
1) Ja ospecifik inbindnig kan resultera i detta, samt även icke optimala förhållanden (t.ex. de respektive temperatirerna för annealing/syntesen/debatureringen, Mg2+ koncentration).
Bättre primers? Längre kanske.
2) reaktionen har skett, men inte optimalt (primer annealing, temperatirerna, koncentrationerna), eller så annealar endast en av primrarna väl och primärt ena strängen amplifiras.
Kanske är templat DNAt skadat eller så debatteras det ej tillräckligt väl, så endast en del kan användas.
