Megaprimer mutagenes
I megaprimer mutagenes används två PCR efter varandra med olika temperatur för att i det första steget producera en megaprimer som i det andra steget används för att skapa den muterade DNA-strängen.
Sker båda PCR stegen upprepade gånger? Annars förstår jag inte hur man kan få en dubbelsträngad megaprimer i första steget. Då skulle väl det bara bildas två långa strängar, varav en har mutationen i ena enkelsträngen? Samma fråga för steg 2.
Hur man megaprimern binda till DNA-sekvensen i steg 2? Vet att det är genom komplementär basparning, men binder den till samma sekvens som vi startade med (i PCR 1)?
fner skrev:I megaprimer mutagenes används två PCR efter varandra med olika temperatur för att i det första steget producera en megaprimer som i det andra steget används för att skapa den muterade DNA-strängen.
Ja det behövs flera steg. Men det kan räcka med 10 steg vid den lägre temperaturen (motsvarande s.k. touch-down), för att skapa tillräckligt med längre "andragenerationsprimrar", vilka används för att bilda slutprodukten i steg två.
Vid den högre temperaturen bör inte mutagenesprimrarna binda lika väl, så länge primern till 5'-änden (long flanking primer i bilden) har ett tillräckligt hög annealing temperatur.
Ofta väljer man att inte köra så många cykler med steg två, för att undvika ytterligare mutationer, och det blir därför inte alltid så mycket slutprodukt bildad.
Sker båda PCR stegen upprepade gånger? Annars förstår jag inte hur man kan få en dubbelsträngad megaprimer i första steget. Då skulle väl det bara bildas två långa strängar, varav en har mutationen i ena enkelsträngen? Samma fråga för steg 2.
Hur man megaprimern binda till DNA-sekvensen i steg 2? Vet att det är genom komplementär basparning, men binder den till samma sekvens som vi startade med (i PCR 1)?
Ja den binder till samma sekvens (mellan mutagenesprimern och "short flanking primer"), så det som sker i steg två är att resten av sekvensen till "long flanking primer" syntetiseras.
Så stället där den mutagena primern i PCR 1 binder till DNA-sekvensen är exakt det ställe där vi kommer ha punktmutationen i produkten från PCR 2?
Ja den binder till samma position. Punktmutationen från primern i reaktion ett, blir en del av megaprimern. På så vis introduceras mutationen i samtliga PCR-produkter.
Denna kloningsstrategi är ett sätt att introducera en punktmutation i en gen. En annan frekvent metod är "Quick change", där mutationen/er kan introduceras genom amplifiering av hela vektorn med mutationen i primrarna.
