Mäta absorbans för proteinkoncentration
Jag vill veta koncentrationen av en immunoglobulin i olika prov som fåtts ur en teoretisk reningsprocess. Jag har i denna process använt en phosphat-buffert för extraktion och utfällning och sedan en tris-buffert till kromatografi.
Nu vill jag mäta koncentrationen via absorbansen vid 280 nm då jag har extinktionskoefficienten för mitt protein.
Är det något jag bör tänka på, eller kan jag "bara" mäta upp kuvetten med mitt prov, och sedan eventuellt späda ut proteinprovet om absorbansen blir för hög/låg? Vad ska jag späda med? Är det med motsvarande buffert som finns i proteinprovet?
Dessutom har jag ytterligare en fundering, nämligen: I de tidiga proverna bör det väl finnas en hel massa andra proteiner också tillsammans med min Ig? Så vid mätning av absorbansen av dessa prov bör man ju få den totala proteinkoncentrationen i provet, dvs inklusive alla andra proteiner utöver Ig?Är det därför en bra metod att mäta absorbansen för att ta reda Ig-koncentrationen i en serie prov från en reningsprocess?
Tack på förhand!
Vad har man använt till nollreferensen när man mätt upp extinktionskoefficienten? Du borde använda samma.
Förhoppningsvis har man valt en våglängd där endast det aktuella proteinet absorberar.
Jag följer ett liknande protokoll, se nedan:
Men visst bör jag göra spädningen med den buffert som proteinet är löst i? Exempelvis innan kromatografi: fosfatbuffert. Efter kromatografi: tris-buffert.
Fosfatbuffert, står det ju i din bild.
Jo visst, de har använt fosfatbuffert för sin utfällning av proteinet.
Jag önskar dock ytterligare ett reningssteg med kromatografi och använder då en tris-buffert för eluering, så mitt protein kommer då att vara löst i tris-buffert.
Då behöver du leta reda på en annan extinktionskoefficient som gäller om proteiner är upplöst i tris-buffert, är jag rädd.
