LC-MS/MS
Hej!
Jag har i en labb använt LC-MS/MS för att beräkna halten ibuprofen i en tablett. Jag har fått två MRM kromatogram där den ena är på ibuprofen och den andra är på en standard lösning. Jag har alltså fått RT=retentionstiden och AA=abundance area. Hur ska jag genom att använda dessa grafer kunna beräkna halten ibuprofen ? Har dels läst att man kan få koncentrationen genom att beräkna arean under kurvan och på annat ställe läst att man ska plotta koncentrationen av lösningen mot arean (förstod inte riktigt hur). Någon som förstår och kan förklara för mig?
Tack på förhand!
Välkommen till Pluggakuten!
Det sista du skriver gissar jag handlar om att undersöka flera kända prov för att få fram en standardkurva. Utan att se dina kurvor är det svårt att säga mer.
Kemia skrev:Hej!
Jag har i en labb använt LC-MS/MS för att beräkna halten ibuprofen i en tablett. Jag har fått två MRM kromatogram där den ena är på ibuprofen och den andra är på en standard lösning.
Det ena är väl ert prov, d.v.s. tabletten? Den andra är standardlösningen eller?
Vad innehöll standardlösningen, var det t.o.m. ibuprofen?
Jag misstänker att du inte angett all information gällande standardprovet - koncentrationen?
Vilka volymer har injicerats i GC instrumentet?
Jag har alltså fått RT=retentionstiden och AA=abundance area. Hur ska jag genom att använda dessa grafer kunna beräkna halten ibuprofen ? Har dels läst att man kan få koncentrationen genom att beräkna arean under kurvan och på annat ställe läst att man ska plotta koncentrationen av lösningen mot arean (förstod inte riktigt hur). Någon som förstår och kan förklara för mig?
Vilken information innehåller retentionstiden? Vad anger den?
Vilken information innehåller arean (antagligen "arean under kurvan", d.v.s. hur stor area hade toppen tillhörande ibuprofenet)?
Nu när jag läst om labbkompendiet flera gånger så har jag kommit fram till att vi ska använda oss av en intern standard med en så kallad ”singel-point calibration” dvs en kalibreringskurva med bara en punkt (en kalibreringsstandard) för att räkna ut mängden ibuprofen. Jag vet dock inte hur jag ska göra? Är det några beräkningar man ska göra eller kan man få en sådan kurva genom graferna?
MRM kromatogram från mitt prov. Två olika fragmenterings intervall.
MRM för standard lösning som innehåller ibuprofen.
Intern standard (IS) brukar man kalla ett referensprov, på just den/de förening(ar) som skall identifieras och kvantifieras.
Då den IS innehåller föreningen av intresse (ibuprofen i ditt fall misstänker jag?) kan samma förening identifieras i ett annat prov, t.ex. din upplösta tablett innehållandes ibuprofen.
Koncentrationen av föreningen(/na) i IS är också kända, då IS lösningen blandats i labbet. Och du bör veta hur mycket material ni injicerade i GC-instrumentet, så då kan du beräkna hur mycket av toppen i IS provet motsvarar i substansmängd eller massa.
Utifrån detta kan du bestämma vilken
1) identifiera, vilken topp i ditt provs kromatogram som är ibuprofenet.
2) kvantifiera vilken mängd ibuprofen ditt prov innehåller, både koncentration och totalmängd (i massa eller substansmängd).
Klura och räkna lite, och vid behov fråga igen.
Har jag räknar rätt?
Massan: 10mg
Molekylvikt: 206.28g/mol
n=0,010/206,28=0,048mmol
C=n/V=0,048/0,1l=0,48mmol/L (Koncentrationen på ibuprofen i intern standard)
"10 mg ibuprofen vägdes upp och löstes i 20 ml vatten och späddes med 80 ml metanol och ställdes i en sonikator. Stamlösningen användes sedan för att göra en standardpunkt med 1mg/ml. 1ml av standarden fördes över till en LC-flaska och 100 ml av den interna standarden tillsattes"
Kemia skrev:Har jag räknar rätt?
Massan: 10mg
Molekylvikt: 206.28g/mol
n=0,010/206,28=0,048mmol
C=n/V=0,048/0,1l=0,48mmol/L (Koncentrationen på ibuprofen i intern standard)
"10 mg ibuprofen vägdes upp och löstes i 20 ml vatten och späddes med 80 ml metanol och ställdes i en sonikator.
Ser ut att stämma.
Stamlösningen användes sedan för att göra en standardpunkt med 1mg/ml. 1ml av standarden fördes över till en LC-flaska och 100 ml av den interna standarden tillsattes"
Det här meningen förstår jag inte. Du behöver formulera om den, för nu låter det som om det är standardpunkter med bestämd koncentration, standard med en volym, och en intern standard (utan koncentration) som tillsätts 100ml av...
Du behöver veta koncentrationen av din IS (vilket du just räknat ut), vilken volym som analyserades (d.v.s. den som injicerades i GC-kolonnen) och hur stor area detta prov gav. Då arean är proportionell till substansmängden, och du vet hur mycket din IS förening som analyserades kan du räkna ut hur stor massa/substansmängd av föreningen en areaenhet (AA) motsvarar i IS provet.
Ditt prov (upplösta pulvret) ger en area, och ifrån den kan du räkna ut hur mycket substans det motsvarar så länge du antar att signalen är proportionell mot IS värdet (d.v.s. 1 AA prov = 1 AA IS).
Kan denna lösning stämma?
Y (standard)=mAU=17824028/10360530=1,7
Y=1,7
K=Y/X
K=1,7/0,48=3,5
Y(provet)=mAU=22283081/81900=272
X=Y/K=272/3,5=76,8mmol/l. Vilket alltså är koncentrationen ibuprofen i provet.
Tänkte att jag måste ju använda graferna som handledaren påpekat flera gånger. Men jag är väldigt osäker om jag tänkt rätt.
Lite svårt att hänga med i vad du presenterar eller vad du räknar (skriv tydligt och låt läsaren spendera tiden på din fråga/resultat istället för att klura ut vad du gjort, det kommer du tjäna på - återkopplingen till dig blir bättre!).
RT brukar vara retentionstiden, d.v.s. den tid får föreningen eluerade ut ifrån GC-kolonnen. Du verkar för bägge kryptogrammen ha räknat fram kvoten mellan AA värdena från två olika RT. Ibuprofenet borde väl endast eluera ut från kolonnen vid en retentionstid?
Att få två olika RT för en förening vid GC går inte.
