Laboration metoder behöve hjälp med tankegången

In situ kan som du skriver detektera mRNA, men samtidigt genen. Så vid lågt/inget uttryck kommer skillnaden mellan signalen från genen vara svår att skilja från signalen från mRNA. Men vid en relativ jämförelse (t.ex. +/- geninducerande stimuli) kan en skillnad ses på mRNA nivån (signalen från DNA bör vara konstant, oavsett ökat/minskat genuttryck).

Men, är det en gen som inte kodar för ett protein (regulatoriskt RNA eller liknande) kommer inte immunohistokemi fungera, för det förutsätter även translation från mRNA till protein - så jag skull välja bort även denna metod - om inte frågan specificerar att genen kodar för ett protein.

, till skillnad från Immunohistochemitry som används för att detektera proteiner (d.v.s. efter genuttrycket)

mag1 skrev:

In situ kan som du skriver detektera mRNA, men samtidigt genen. Så vid lågt/inget uttryck kommer skillnaden mellan signalen från genen vara svår att skilja från signalen från mRNA. Men vid en relativ jämförelse (t.ex. +/- geninducerande stimuli) kan en skillnad ses på mRNA nivån (signalen från DNA bör vara konstant, oavsett ökat/minskat genuttryck).

Håller med dig om immunohistokemin, bara för att ett protein inte finns innebär det ju inte att genen inte är utryckt. 

Fattar jag dig rätt på första stycket. Problemet med in situ är alltså att den även detekterar genen i DNA:t så även om den inte utrycks så syns det fortfarande som att den utrycks. Samt att om den utrycks lite syns det inte om den utrycks för att genen på DNA:t kan lura en?

RisPris skrev:

mag1 skrev:

In situ kan som du skriver detektera mRNA, men samtidigt genen. Så vid lågt/inget uttryck kommer skillnaden mellan signalen från genen vara svår att skilja från signalen från mRNA. Men vid en relativ jämförelse (t.ex. +/- geninducerande stimuli) kan en skillnad ses på mRNA nivån (signalen från DNA bör vara konstant, oavsett ökat/minskat genuttryck).

Håller med dig om immunohistokemin, bara för att ett protein inte finns innebär det ju inte att genen inte är utryckt. 

Fattar jag dig rätt på första stycket. Problemet med in situ är alltså att den även detekterar genen i DNA:t så även om den inte utrycks så syns det fortfarande som att den utrycks. Samt att om den utrycks lite syns det inte om den utrycks för att genen på DNA:t kan lura en?

Ja, det var det jag menade. Det kan med in situ fås en signal även ifrån DNA:t, men den är så klart mycket svag (få kopior). Genomet är vanligtvis delvis kondenserat, så om den aktuella genen finns i kondenseradt DNA kan ingen hybridisering ske. Så för gener som inte uttrycks, för att de är otillgängliga/kondenserade kommer en mycket svag signal ses med in situ - om du jämför med signalen från en cell med många många kopior av mRNA syntetiserat från genen.

Vänta lite nu jag är inte med i svängarna, det du säger i slutetet har mig lite förirrad, 

"Så för gener som inte uttrycks, för att de är otillgängliga/kondenserade kommer en mycket svag signal ses med in situ - om du jämför med signalen från en cell med många många kopior av mRNA syntetiserat från genen." 

Borde inte det innebär att det är en lämplig metod för att detektera utrycket av en gen i vävndad eftersom man kan jämföra de två olika alternativen. Sedan förstår jag inte hur den kan ge signal om det inte binner in, hur funkar det? Primern/proben ger väl bara ifrån signal om den binder in? I en kondenserad chromsome kan den ju inte

RisPris skrev:

Vänta lite nu jag är inte med i svängarna, det du säger i slutetet har mig lite förirrad, 

 

"Så för gener som inte uttrycks, för att de är otillgängliga/kondenserade kommer en mycket svag signal ses med in situ - om du jämför med signalen från en cell med många många kopior av mRNA syntetiserat från genen." 

 

Borde inte det innebär att det är en lämplig metod för att detektera utrycket av en gen i vävndad eftersom man kan jämföra de två olika alternativen.

Jo precis, om genen inte uttrycks fås ingen signal starkare än bakgrunden (som blir "nollnivån" vid en jämförelse).

Sedan förstår jag inte hur den kan ge signal om det inte binner in, hur funkar det? Primern/proben ger väl bara ifrån signal om den binder in? I en kondenserad chromsome kan den ju inte

Kanske var otydlig, det blir ingen signal starkare än bakgrunden.

men då är vi tillbaka till början igen, hur kan det då vara rätt svar? 

Det är rätt att metoderna 2-4 är mer lämpliga för att se uttrycket av en gen (med undantaget att det måste vara en proteinkodande gen i 4).

Men kruxet med in situ är att det även ger en signal för genen i DNA - så även om genen inte uttrycks kommer en signal fås. Och detta skiljer sig från 2-4, där signalen som mäts ökar när genen uttrycks.

mag1 skrev:

Det är rätt att metoderna 2-4 är mer lämpliga för att se uttrycket av en gen (med undantaget att det måste vara en proteinkodande gen i 4).

Men kruxet med in situ är att det även ger en signal för genen i DNA - så även om genen inte uttrycks kommer en signal fås. Och detta skiljer sig från 2-4, där signalen som mäts ökar när genen uttrycks.

Håller inte riktigt med dig här, hur kommer det sig att den kan binda till DNA om proben är av mRNA och komplementär med enbart RNA och inte DNA? 

RisPris skrev:

mag1 skrev:

Det är rätt att metoderna 2-4 är mer lämpliga för att se uttrycket av en gen (med undantaget att det måste vara en proteinkodande gen i 4).

Men kruxet med in situ är att det även ger en signal för genen i DNA - så även om genen inte uttrycks kommer en signal fås. Och detta skiljer sig från 2-4, där signalen som mäts ökar när genen uttrycks.

Håller inte riktigt med dig här, hur kommer det sig att den kan binda till DNA om proben är av mRNA och komplementär med enbart RNA och inte DNA? 

Proben kan antingen vara av DNA eller RNA, men det spelar ingen roll - för båda kan komplementärt para sina nukleotidbaser med varandra.

Precis som när transkriptionen sker - då DNA används som templat och en mRNA syntetiseras efter att nukletodibaserna basparat mellan DNA och RNA.