Kloningsvektor pUC19
I min lärobok beskriver de hur man kan klona en gen med hjälp av kloningsvektorn pUC19. Då beskriver de att plasmiden innehåller framändan av lacZ och att i den finns olika ”sites” för restriktionsenzym. Jag förstår varför de ”sitsen” är i den selektionsmarkören, för att om plasmiden blivit rekombinant så kan inte den genen uttryckas längre.
Det jag inte förstår är vad som menas med att plasmiden innehåller framänden av lacZ. För det står också att plasmiden och bakterien samarbetar för att producera β-galaktosidas, och att plasmiden bidrar med framändan av genen och bakterien bakändan av genen. Först så tänkte jag att de menade att plasmiden innehåller promotor eller liknande för lacZ, men promotorn är ju cis-agerande, så det stämmer ju uppenbarligen inte. När jag har försökt googla på det så framstår det som att det bokstavligen är en del av lacZ som sitter på plasmiden. Men hur fungerar det isåfall? Då borde ju den delvisa lacZ på bakterien och den delvisa lacZ på plasmiden båda två bara producera ofullständiga mRNA? Kan de tillsammans producera β-galaktosidas? Och varför går det inte att göra det då trots att ett restriktionsenzym klipper i DNAt? Då borde det ju bara bli 3 ofullständiga mRNA istället? Eller består β-galaktosidas av 2 olika aminosyrakedjor, så även vid vanlig translation av genen så bildas två olika aminosyrakedjor som tillsammans bildar β-galaktosidas? När de beskriver lac-operonet i min bok så beskrivs nämligen inte att så skulle vara fallet, så därför blir jag förvirrad.
sund20 skrev:I min lärobok beskriver de hur man kan klona en gen med hjälp av kloningsvektorn pUC19. Då beskriver de att plasmiden innehåller framändan av lacZ och att i den finns olika ”sites” för restriktionsenzym. Jag förstår varför de ”sitsen” är i den selektionsmarkören, för att om plasmiden blivit rekombinant så kan inte den genen uttryckas längre.
Det jag inte förstår är vad som menas med att plasmiden innehåller framänden av lacZ.
Om författarna använt ordet "framända" är det ett olyckligt ordval, som inte beskriver verkligheten så väl. Vad pUC19 innehåller, och vad jag tror författaren försökte förmedla, är att det inte är hela lacZ genen i denna vektor, utan endast den första delen av genen. Från denna del av genen kan endast en del av beta-laktamaset bildas, d.v.s. det bildade kodande mRNAt innehåller inte all information för att bilda det fullständiga aktiva enzymet, endast "första halvan".
För det står också att plasmiden och bakterien samarbetar för att producera β-galaktosidas, och att plasmiden bidrar med framändan av genen och bakterien bakändan av genen. Först så tänkte jag att de menade att plasmiden innehåller promotor eller liknande för lacZ, men promotorn är ju cis-agerande, så det stämmer ju uppenbarligen inte. När jag har försökt googla på det så framstår det som att det bokstavligen är en del av lacZ som sitter på plasmiden. Men hur fungerar det isåfall? Då borde ju den delvisa lacZ på bakterien och den delvisa lacZ på plasmiden båda två bara producera ofullständiga mRNA? Kan de tillsammans producera β-galaktosidas? Och varför går det inte att göra det då trots att ett restriktionsenzym klipper i DNAt? Då borde det ju bara bli 3 ofullständiga mRNA istället? Eller består β-galaktosidas av 2 olika aminosyrakedjor, så även vid vanlig translation av genen så bildas två olika aminosyrakedjor som tillsammans bildar β-galaktosidas? När de beskriver lac-operonet i min bok så beskrivs nämligen inte att så skulle vara fallet, så därför blir jag förvirrad.
Vissa E. coli stammar har konstruerats så att de i sin kromosomala kopia av lacZ genen har en större deletion av beta-laktamasgenen, i 5-änden. Resterande del kan bildas från de bildade mRNA, men ger själva endast den "andra halvan" av enzymet, som då den är ofullständig även är inaktiv. Och det är det som är den fiffiga delen med att kombinera dessa stammar med pUC19.
Dessa E. coli stammar kan inte bilda en funktionell form av beta-galaktosidaset själva, men tillsammans med mRNA kodande för den partiella lacZ genen från pUC19 vectorn, kan två separata delar av enzymet bildas var och en för sig, och sedan binda till varandra, varpå en fullständig form av det och aktiva enzymet uppstår (från de två separata polypeptiderna).
lacZ genen är endast där för att enkelt sköta selektionen av de bakterier, vilka innehåller pUC19 vektorn med något inklonat i.
mag1 skrev:sund20 skrev:I min lärobok beskriver de hur man kan klona en gen med hjälp av kloningsvektorn pUC19. Då beskriver de att plasmiden innehåller framändan av lacZ och att i den finns olika ”sites” för restriktionsenzym. Jag förstår varför de ”sitsen” är i den selektionsmarkören, för att om plasmiden blivit rekombinant så kan inte den genen uttryckas längre.
Det jag inte förstår är vad som menas med att plasmiden innehåller framänden av lacZ.
Om författarna använt ordet "framända" är det ett olyckligt ordval, som inte beskriver verkligheten så väl. Vad pUC19 innehåller, och vad jag tror författaren försökte förmedla, är att det inte är hela lacZ genen i denna vektor, utan endast den första delen av genen. Från denna del av genen kan endast en del av beta-laktamaset bildas, d.v.s. det bildade kodande mRNAt innehåller inte all information för att bilda det fullständiga aktiva enzymet, endast "första halvan".
För det står också att plasmiden och bakterien samarbetar för att producera β-galaktosidas, och att plasmiden bidrar med framändan av genen och bakterien bakändan av genen. Först så tänkte jag att de menade att plasmiden innehåller promotor eller liknande för lacZ, men promotorn är ju cis-agerande, så det stämmer ju uppenbarligen inte. När jag har försökt googla på det så framstår det som att det bokstavligen är en del av lacZ som sitter på plasmiden. Men hur fungerar det isåfall? Då borde ju den delvisa lacZ på bakterien och den delvisa lacZ på plasmiden båda två bara producera ofullständiga mRNA? Kan de tillsammans producera β-galaktosidas? Och varför går det inte att göra det då trots att ett restriktionsenzym klipper i DNAt? Då borde det ju bara bli 3 ofullständiga mRNA istället? Eller består β-galaktosidas av 2 olika aminosyrakedjor, så även vid vanlig translation av genen så bildas två olika aminosyrakedjor som tillsammans bildar β-galaktosidas? När de beskriver lac-operonet i min bok så beskrivs nämligen inte att så skulle vara fallet, så därför blir jag förvirrad.
Vissa E. coli stammar har konstruerats så att de i sin kromosomala kopia av lacZ genen har en större deletion av beta-laktamasgenen, i 5-änden. Resterande del kan bildas från de bildade mRNA, men ger själva endast den "andra halvan" av enzymet, som då den är ofullständig även är inaktiv. Och det är det som är den fiffiga delen med att kombinera dessa stammar med pUC19.
Dessa E. coli stammar kan inte bilda en funktionell form av beta-galaktosidaset själva, men tillsammans med mRNA kodande för den partiella lacZ genen från pUC19 vectorn, kan två separata delar av enzymet bildas var och en för sig, och sedan binda till varandra, varpå en fullständig form av det och aktiva enzymet uppstår (från de två separata polypeptiderna).
lacZ genen är endast där för att enkelt sköta selektionen av de bakterier, vilka innehåller pUC19 vektorn med något inklonat i.
Men varför kan det då inte skapas ett protein trots att den delvisa lacZ genen på plasmiden "brutits" genom att ett främmande DNA-segment satts in där? Det borde ju då istället bara bli 3 mRNA - 2 från plasmiden (där den främre/5'-delen av lacZ genen delats upp i två delar) och ett större mRNA (andra halvan) från kromosomen?
Det är kanske inte intuitivt hur detta fungerar. Och det stämmer, stoppas en ytterligare DNA sekvens in i den partiella lacZ genen i pUC19 vektorn, så kan resultatet blir att det blir ett mRNA med sekvensen kodande för:
(liten bit lacZ)-(genen som klonades in)-(resten av det partiella lacZ från pUC19 vektorn)
Och den bildade polypeptiden motsvarar då dessa proteinbitar.
Men, i och med att genen klonas in m.h.a. restriktions site, kan sekvensen kombineras med restriktions sitet, så att den partiella lacZ genen i pUC19 vektorn förstörs (t.ex. genom frame shift), medans DNA sekvensen som klonas in leder till ett mRNA, vilket kan translateras av cellens ribosom.
Oavsett introduceras ett stopkodon i slutet av DNA sekvensen för genen som man önskar, så att transkriptionen stannar efter genen, d.v.s. allt annat som följer efter i vektorn (resten av den partiella lacZ genen) ignoreras vid transkriptionen.
