Jonbyteskromatografi: koncentration på elueringsbuffert
Hej. Jag undrar hur man tänker kring val av koncentration på elueringsbufferten vid jonbyteskromatografi. Vi skall rena fram ett protein digitalt och i ett av stegen ska man välja ett intervall på koncentration av elueringsbuffert och motivera varför man valde just de värdena. Vår lärare visade hur hon gjorde men motiverade inte varför hon valde sina koncentrationer. Hon verkade testa sig fram men när man gör reningen på riktigt på labb kan man ju inte hålla på så, eller? Först valdes 0,01 - 0,5 M men då eluerades inte enzymet av intresse ut, så då ändrade hon till 0,01 - 1,0 M. Har försökt leta på nätet utan framgång, så hoppas på tur här.
Du anger inte vilken koncentrationen är, d.v.s. vilket salts koncentration som ökar under elueringssteget, men det är ofta natriumklorid, därför svarar jag utifrån att "koncentrationen" är koncentrationen av natriumkloridlösningen.
Ju starkare en molekyl, som ett protein, adsorberas till jonbytesmaterialet, beror på fler faktorer, bl.a. pH (påverkar proteinets laddning), koncentrationen av (olika) joner i bufferten. Och det sista är det som utnyttjas för att eluera t.ex. ett protein, där en ökande koncentration av NaCl leder till att proteinet inte längre binder till kolonnen, och istället elueras.
I "ett riktigt labb" får utövaren, försöka förutspå hur elueringen kan gå, men till slut blir det till att prova - om antagandena stämmer, och proteinet elueras ut (gärna så rent som möjligt).
Om koncentrationen av saltet var 10mM i provet, och kolonnen ekvilibrerats med detta, är det inte orimligt att prova mellan 0,01-1 M NaCl. Eluerar proteinet ut tidigt, och tillsammans med andra proteiner, kan en lägre slutkoncentration användas och/eller en lägre elueringsperiod (d.v.s. koncentrationen ökar långsammare, och över en större volum). Eluerar inte proteinet ut vid 1 M så får kan saltkoncentrationen ökas och/eller pH ändras.
