Jästsuspension, etanol, cellmembran, diffusion, neutralrött
Hej! För några veckor sen utförde jag en labb och skriver just nu en labbrapport, men det har uppkommit ett frågetecken jag försökt reda ut i flera dagar nu men kommer ingen vart. Såhär ser problemet ut:
I ett provrör tillsätts 4 ml avjonat vatten, 5 ml jästsuspention med nahco3-buffert, 1 ml 95% etanol samt tre droppar neutralrött. Därefter centrifugerades blandningen.
Neutralrött fungerar som en pH-indikator med omslagsintervall mellan pH 6,8 och 8. Lågt pH: Röd färg och positivt laddad. Nedan benämnd Neu-H⁺. Högt pH: gulorange färg och oladdad. Nedan benämnd Neu. Neu-H⁺ + H₂O ⇆Neu + H₃O⁺ (Wikipedia)
Pelleten som ansamlats i botten av röret pga centrifugen är rödfärgad vilket inte är så konstigt då oladdade neutralröttmolekyler diffunderat genom cellmembranet och reagerat med det sura H+. Men vad jag inte lyckas förstå är varför supernatanen är orange?!
Dessutom är ett annat provrör där det tillsattes 5ml etanol helt basisk efter centrifugen, alltså både pelleten och supernatanen? Tilläggas kan är att lösningarna var sura innan innan centrifugen kom.
Är det etanolen som reagerar med något så det blir basiskt? Eller är det att etanolen dödar jästen som leder till att något basiskt ämne frigörs? Men hur i så fall när det klart och tydligt är surt i cytoplasman?
Tacksam för svar!
Supernatanten är väl basisk, därför blir den orangefärgad? Etanolmolekylerna lär förstöra cellmembranen så att supernatanten kan flöda in i cellen vilket gör att det blir en basisk miljö även där. Det är ungefär så som handsprit fungerar, dvs man avdödar bakterier genom att etanolen förstör deras cellmembran.
Nja, jag har sammanlagt gjort 7 prover varav ett av d enbart innehöll avjonat vatten, och då har inte supernatanen varit basisk utan sur. Dessutom var provröret surt tills centrifugen då det helt oväntat bytte till att vara en basisk lösning.
Färgen på ett prov beror på allt som finns i provet. Att lösningens färg ändrades efter centrifugeringen är inte underligt om du tänker på hur neutralrött fungerar. Finns det inga celler bestäms färgen enbart av pH i lösningen (i princip av natriumvätekarbonatbufferten ni tillsätter). Men finns det celler, och dessa celler tar upp en del av pigmentet (neutralrött) - kan färgen på pigmentet inuti cellerna ändras (p.g.a. pH i vissa av cellens organeller skiljer sig ifrån bufferten).
Så i detta fall har du en summa av alla färger, som består av pigmentets färg i bufferten (gul vid pH över 8.0) samt pigmentet i cellens olika organeller (vissa är sura, varpå neutralrött blir rött). Och denna summa är vad ni såg innan centrifugering.
Efter centrifugeringen separerades cellerna (till pelleten) från lösningen - därför kan de ha olika färger - det är helt enkelt två olika volymer (supernantanten med vätskan, och pelleten med cellernas innehåll).
Neutralrött kan bara ta sig igenom cellernas membran då ämnet är oladdat (d.v.s. innan neutralrött tar upp en proton och får laddningen plus 1). Vid lägre pH tar neutralrött upp en proton, blir laddat, och kan därför inte diffundera igenom cellens membran (det är därför färgen ackumuleras i jästcellernas organeller och färgar cellerna röda).
Etanolen påverkar membranen i cellerna (och blir koncentrationen tillräckligt hög dör cellen för membranen skadas för mycket, som Teraeagle skrev), och gör membranen mer genomsläppliga för bl.a. neutralrött. Så hur tror du det kan påverka färgen på supernantanten?
mag1 skrev:Färgen på ett prov beror på allt som finns i provet. Att lösningens färg ändrades efter centrifugeringen är inte underligt om du tänker på hur neutralrött fungerar. Finns det inga celler bestäms färgen enbart av pH i lösningen (i princip av natriumvätekarbonatbufferten ni tillsätter). Men finns det celler, och dessa celler tar upp en del av pigmentet (neutralrött) - kan färgen på pigmentet inuti cellerna ändras (p.g.a. pH i vissa av cellens organeller skiljer sig ifrån bufferten).
Så i detta fall har du en summa av alla färger, som består av pigmentets färg i bufferten (gul vid pH över 8.0) samt pigmentet i cellens olika organeller (vissa är sura, varpå neutralrött blir rött). Och denna summa är vad ni såg innan centrifugering.
Efter centrifugeringen separerades cellerna (till pelleten) från lösningen - därför kan de ha olika färger - det är helt enkelt två olika volymer (supernantanten med vätskan, och pelleten med cellernas innehåll).
Neutralrött kan bara ta sig igenom cellernas membran då ämnet är oladdat (d.v.s. innan neutralrött tar upp en proton och får laddningen plus 1). Vid lägre pH tar neutralrött upp en proton, blir laddat, och kan därför inte diffundera igenom cellens membran (det är därför färgen ackumuleras i jästcellernas organeller och färgar cellerna röda).
Etanolen påverkar membranen i cellerna (och blir koncentrationen tillräckligt hög dör cellen för membranen skadas för mycket, som Teraeagle skrev), och gör membranen mer genomsläppliga för bl.a. neutralrött. Så hur tror du det kan påverka färgen på supernantanten?
Först tog jag pH utan tillsats av suspension och då var det surt. Jag köper att färgen som visas är en av pH i hela blandningen efter tillsats av suspension. Men alkoholens pH är 7 och suspensionens var 7,3 så att den var röd och borde vara röd är logiskt. Förstår fortfarnade inte varför supernatanen är orange? Om cellmembranen förstör och läcker ut borde pH bli ännu lägre inte basiskt?
RickandMorty skrev:
Först tog jag pH utan tillsats av suspension och då var det surt. Jag köper att färgen som visas är en av pH i hela blandningen efter tillsats av suspension. Men alkoholens pH är 7 och suspensionens var 7,3 så att den var röd och borde vara röd är logiskt. Förstår fortfarnade inte varför supernatanen är orange? Om cellmembranen förstör och läcker ut borde pH bli ännu lägre inte basiskt?
Fast neturalröd är ju helt röd vid pH under 6.8. Så det låter inte helt otroligt att pH är lite högre än så med dina andra lösningar? Ju högre pH blir, ifrån pH 6.8, desto större andel av pigmentets molekyler kommer protolyseras och då få en gul färg. Och summan av alla molekylers färg (röd/gul) ger lösningens färg.
