Hur kan PCR användas för att jämföra genuttryck?
Om man använder cDNA i PCR, så ska man kunna jämföra genuttrycket mellan olika celler. Ju större genuttryck, desto större mängd DNA. Jag förstår inte varför detta fungerar? cDNA är, som jag förstått det, DNA som skapats av mRNA. På vilket sätt skulle detta kunna leda till att man kan se genuttrycket?
cDNA ("c" från engelskans complementary, d.v.s. komplementär) skapas genom reverse transcriptase (RT) enzym (som på svenska gör en "åter transkription"), d.v.s. syntetiserar DNA utifrån mRNA. Precis tvärt om vad som vanligtvis sker i våra celler. RT används i naturen av vissa RNA-virus, som skapar en DNA kopia av sitt RNA-genom material, stoppar in det i våra kromosomer och sedan använder vårt RNA-polymeras för att skapa sina proteiner och sitt RNA-genom.
Tillbaka till PCR användandet. mRNA mängden ökar med ökat genuttryck. Men (m)RNA är instabilt, då vi har utvecklat ett avancerat system för att begränsa livslängden hos vårt mRNA (är det för stabilt, kan t.ex. inte genuttrycket minska lika snabbt), samt förstöra RNA som inte är från våra celler (en försvarsmekanism, mot t.ex. virus RNA-genom). Så för undvika att allt mRNA bryts ner, används RT för att bilda betydligt mycket mer stabila cDNA kopior genom PCR.
Under PCR med RT bildas kopior i form av cDNA, och under de upprepade PCR-cykler ökar koncentrationen av cDNA. Och ju fler mRNA molekyler det finns, desto fler cDNA kopior bildas.
Mängden bildat cDNA kan i sin tur kan mätas t.ex. spektroskopi. Där absorbansen av en viss koncentration DNA ger en specifik absorbans, så ju högre koncentration av cDNA desto högre absorbans.
