Hur fungerar jonbyteskromotografi?
Jag har suttit och tänkt på detta ett tag nu. Men i jonbyteskromotografi använder man ju motsatta laddning till proteinexktraktet i kolonmassan. Detta resulterar i att proteinexktraktet man vill ha binder fast i kolonet.
Min fråga är då hur får man ut protein extraktet?
Jag tänkte själv att man antingen använder något som proteinexktraktet drar sig till hårdare. Men är detta rätt och finns det ett annat svar?
Man använder ett salt med joner som binder till kolonnen. Om det är en jonbytare med som binder positivt laddade joner och man sätter till NaCl-lösning med en tillräckligt hög koncentration så kommer Na+-jonerna att konkurrera med proteinerna så att proteinerna släpper och natriumjonerna binder i stället.
För att eluera (=få ut något ur t.ex. en kolonn) behöver interaktionen mellan proteinet och kolonnens material brytas, då förs proteinet med vätskan ut ur kolonnen. I detta fall vet du vilken typ av interaktion det gäller (namnet på kromatografimetoden).
Denna interaktion kan teoretiskt brytas med protein, men det är enklare att använda andra laddade partiklar lösta i vatten - kan du komma på några? Kanske något som kan lösas i vatten?
mag1 skrev:För att eluera (=få ut något ur t.ex. en kolonn) behöver interaktionen mellan proteinet och kolonnens material brytas, då förs proteinet med vätskan ut ur kolonnen. I detta fall vet du vilken typ av interaktion det gäller (namnet på kromatografimetoden).
Denna interaktion kan teoretiskt brytas med protein, men det är enklare att använda andra laddade partiklar lösta i vatten - kan du komma på några? Kanske något som kan lösas i vatten?
tänker jag rätt om jag använder SvanteR metod, att det beror på laddningen av kolonet. Om den exempelvis är positiv kan jag använda mig av Cl? Ifall den är negativ använder jag Na
Är det samma princip som används för affinitetskromotografi och gel-, fast att jag ändrar det till olika protein som kan binda in istället? och för gel är det bara att vänta tills de större partiklarna eluerats?
Ja, det går då de joner som interagerar med kolonnen har motsatt laddning (och samma laddning som ditt protein). Men vanligtvis används en saltlösning, d.v.s. med både Na+ och Cl-. Detta då en av jonerna t.ex. Cl- kommer interagera med kolonnen (om den är positivt laddad) och Na+ kommer interagera med ditt protein (och skärma det från kolonnens positiva laddningar). Merparten av alla laddade partiklar kommer dock rinna rakt igenom kolonnen.
Vad som används för eluering av protein från en affinitetskolonn beror på vilken typ det är, men tillsätts tillräckligt hög koncentration av Na+ och Cl- kommer interaktionen mellan proteinet och kolonnen brytas. I vissa fall klarar inte proteinet av en så hög koncentration av salt, utan denaturerar, men då kan andra partiklar tillsättas som t.ex. liknar en av de två parter som interagerar vid affinitetskromatografi.
Vid gelfiltrering sker ingen adsorbtion till kolonnen utan separationen av provets innehåll sker då små partiklar (t.ex. salter) tar sig in i de korn kolonnen består av och tar då en längre väg, och eluerar senare. För mindre proteiner så blir vägen lite längre, och för stora som inte alls kan få plats i och omkring kornen så blir vägen kortare och de eluerar först.
