Utveckling av aptamer, "neanderbodies"
Jag förstår inte 3 b) eller c). Jag svarade bara att man kan odla de utsorterade cellerna igen, men vadå "change parameter to preferentially enrich HER2 binding neanderbodies?
3b)
Jo du skulle kunna odla dem igen, med trycket på att ändra variable-regionen ytterligare. NNK metoden användes på mRNAt (generation V0), i 2b och gav HER2-bindingspositiva mutanter, som selekterades FACS (V1). Du behöver iterera mutagenessteget på dina HER2-bindingspostiva kloner (V1) för att ansamla ytterligare mutationer, där den sammanlagda ökningen i neader-body affiniteten kan bli betydligt högre än respektive punktmutation. Fundera på om du kan använda en variant av mutagenesen från 2b, med V1 bindarna som tempat, eller kanske till och med denegererade primrar.
3c)
Detta är väl bara en fråga om selektion av de kloner med högre affinitet än V1 generationen? Detta är enkelt gjort med framrenat protein, men det går ju inte i denna uppgift. Kan du göra denna selektion på cellnivå?
3b) Men om jag muterar V1, blir det inte bara sämre? Ska vi mutera dem "bara lite"?
3c) ursäkta, jag var lite borta, jag hade redan gjort uppgiften, men jag svarade inte det du skrev. Jag skrev bara att vi kan sekvensera de utsorterade cellerna, jätteenkelt. Jag antar att vi transformerade in de i vektorer som har känd sekvens?
3b) Du muterar din V1 ytterligare, merparten av ditt nya klonbibliotek (V2) kommer ha sämre affinitiet, men för att öka bindiningsstyrkan behöver V-regionen muteras, så dessa iterationer är nödvändiga. De mutanter i V2 som har sämre affinitet kan väljas bort, och de som har högre affinitet än V1 väljs ut till nästa vända - och så fortgår det tills ökningen av affiniteten planar ut.
En eller flera förändrade aminosyrarester i V-regionen, gav affinitet för HER2. Ytterligare förändringar är det enda viset att hitta den aminosyrasekvensen i V-regionen som är optimal, d.v.s. med maximal affinitet.
3c) Nja inte nödvändigtvis. Sekvensering och eventuell uppskalning för rekombinant proteinproduktion kan ske efter att en tillräckligt bra klon hittats (när affiniteten när ett visst värde eller inte ökar mer). Under denna typ av random-mutagenes så screenar du efter en förbättring, men du behöver inte sekvensera V-regionen från varje utvald klon. Det kostar i och för sig lite idag, men med ett större bibliotek och fler generationer så kan kostnaden dra i väg.
3b) det jag menar är att ALLA möjliga strängar redan fanns i V0, de dåliga filtrerades bort. Om vi då har V1 och muterar dem så får vi bara tillbaka "de dåliga" igen. Men jag tolkar det som att vi inte hade ALLA möjliga redan i V0.
3c) Men jag tolkade av frågan att vi var nöjda redan med affiniteten och att vi i detta stadiet vill veta sekvensen av de utvalda strängarna.
Nu undrar jag om fråga 13 b). Den verkar konstig. Den reguleras varken transkriptionsnivå eller post-transkriptions nivå. Den regleras ju när den är färdig, alltså post-translationellt.
Vad för "small geneous molecule" skulle vara smart att använda i detta sammanhang?
Qetsiyah skrev:3b) det jag menar är att ALLA möjliga strängar redan fanns i V0, de dåliga filtrerades bort. Om vi då har V1 och muterar dem så får vi bara tillbaka "de dåliga" igen. Men jag tolkar det som att vi inte hade ALLA möjliga redan i V0.
Vid site-directed mutagenes, som t.ex. NNK försöker man skapa en full saturation mutangenesis för en aminosyrarest i taget. Det är i och för sig möjligt att med tillräckligt många degenererade primrar få ett bibliotek som är stort nog att täcka alla kombinationer med alla resi. muterade. Om detta inte var vad du menade, missas potentiella ökningar av affiniteten genom effekten av mer än en mutation.
Qetsiyah skrev:
3c) Men jag tolkade av frågan att vi var nöjda redan med affiniteten och att vi i detta stadiet vill veta sekvensen av de utvalda strängarna.
Nja, det var väl experiment för att studera de utvalda klonerna innan sekvensering/proteinproduktion?
Qetsiyah skrev:Nu undrar jag om fråga 13 b). Den verkar konstig. Den reguleras varken transkriptionsnivå eller post-transkriptions nivå. Den regleras ju när den är färdig, alltså post-translationellt.
Vad för "small geneous molecule" skulle vara smart att använda i detta sammanhang?
Ja frågan är nog lite lurig. Svaret beror på hur definierar du "on-switchen", d.v.s. vilka komponenter krävs för att on-switch skall fungera?
