Hematoxylin&eosin färgning vs IHC
Hej, jag är förvirrad av terminologin kring vävnadsfärgning. Stämmer det att HE färgning INTE räknas som en IHC metod eftersom den inte involverar antikroppar? Däremot används den (vanligen?) i samband med IHC som counterstain? En counterstain behöver dock inte göras med H&E utan kan (i princip) göras med en annan immunofärgning?
IHC är baserat på identifikationen av antigen, medelst en antikropp. HE är baserat på kemiska föreningar, så de bör väl anses avvika ifrån IHC staining, så ditt resonemang låter med andra ord helt korrekt. HE används väl inte i sig som counterstain, utan eosin används som counterstain till haematoxylin (även om bägge ingår i HE). Bägge kan i och för sig användas som counterstain till en fluorescerande antikropp.
Men du har rätt en counterstain kan i princip vara ett annat ämne, vilket inte färgar som det första ämnet (primär stain eller likande), utan färgar en annan typ av cell/organell etcetera, t.ex. Nuclear Fast Red som färgar cellkärnan, eller för den delen Hoechst stain som färgar DNA. Dessa kan användas som komplement (conterstain) till en första stain, för att t.ex. jämföra med eller se kolokalisation/olika lokalisation av ett agent, t.ex. ytantigen jämfört med cellkärnan, eller spectrin för att se cellskelettet jämfört med ett membranprotein i cellmembranet, organellspecifik lokalisation av ett protein via IHC och sedan spektrinstain för att se cellens membran (membranets insida) eller nucleous/DNA. IHC som en kombination av olika antikroppar med varsin unik fluorescens, kan ge snygga bilder med vissa/enstaka cellkomponenter illuminerade vid en våglängd och t.ex. ett specifikt protein vid en annan våglängd.
Hm nej, jag pratar om en enzymlänkad IHC som bakgrundsfärgas (counterstain) med HE, låter det knasigt? De gjorde så i en youtubevideo, för mig låter det konstigt för kloroforen (som bildas av det kopplade enzymet) borde ju försvinna efter alla stegen som HE involverar? De gjorde alltså HE efter IHC
Okej, så en enzymkonjugerad antikropp, där enzymet ger upphov till en fluorofor, följt av counterstain med HE, tolkar jag det som. Vid HE infärgningen kan så klart den bildade fluoroforen tvättas bort, men så länge fluoroforen immobiliseras efter bildadet så borde det gå bra. Är t.ex. lösligheten väldigt låg, kommer fluoroforen adherera/aggregera med hydrpfoba cellkomponenter, som (denaturarade) proteiner, membran. Ämnet, som enzymet modifierar till fluoroforen, behöver ha en hyfsad löslighet för att kunna fås att diffundera in i cellerna etcetera, men efter enzymatisk klyvning så är det en fördel om den bildade fluoroforen är olöslig - så att fluoroforen "fastnar" på den platsen där den bildas, d.v.s. vid antikroppens epitop. Genom att enzymet bildar fluoroforen, kan substatets och produktens olika löslighet untyttjas.
Superbra svar! Got it!
Men jag har en till fråga, de använder polymer HRP metod:
Men ett enzym är verkligen inte så liten som i bilden, de ska ju vara minst lika stora som antigenet eller antikroppen i bilden. Påverkar det inte inbindningen när den sekundära antikroppen är kopplad till polymeren på det sättet?
Jo enzymet har samma storleksordning som antikroppen. Anigenet kan vara både mindre eller större än antikroppen (epitopen är mindre det oavsett). Bilden är nog mer illustrativ, för att visa att många enzymmolekyler ansamlas till samma plats som antigenet. Antikroppens inbindning kan nog påverkas, men i och med att det finns flera sekundär antikroppar på samma dextranpolymer, och ännu fler enzymmoleyler, så blir enzymaktiviteten högre med denna polymer. Och därmed en högre fluorescenssignal.
Detta kan t.ex. användas för antigen som har en låg koncentration, och därmed endast skulle ge en låg signal, eftersom endast ett fåtal sekundära antikroppar med konjugerat enzym skulle bindas till antigenet. Finns det fler antigen i närheten binder kan fler antikroppar från polymeren binda (vilket ökar bindningsstyrkan). Så det kan även kompensera för en antikropp med lägre bindningsstyrka. Antikroppsaffiniteten för antigenet är ofta reda tillräckligt hög föra att säkerställa att antikroppen (med konjugerade molekyler) sitter fast ordentligt.
Dissociationskonstanterna (Kd) för (primär/sekundär) antikropp/antigen varierar så klart, men mellan mM och nM är inte ovanligt för kommersiella antikroppar (även om det går att få upp mot pM). Och med flera inbindande sekundära antikroppar, minskar dissociationskonstanten dramatiskt, även om den största fördelen nog är att många kopior av enzymet ansamlas per antigen via polymeren.
