Gelelektrofores analys av längd av ursprungs sekvens?
Hej, vi gjorde nyligen en laboration där vi använde oss av restriktionsenzym och klippte upp DNA och hade den därefter genom gelelektrofores. Vi hade en stege där vi mäta ut längden av varje steg och milimeter och skapade en graf. Enligt uppgiften skulle vi besluta längden av hela DNA sekvensen. Vi mätte då vardera längd mellan brunnen och banden och adderade de samman. Problem jag har med detta är dock, hur kan vi veta att detta är hela DNA-sekvensen längd, borde det inte vara möjligt att flera DNA-sekvenser med samma längd hamnar på samma band, borde detta inte i sin tur öppna möjligheten till att ursprungs DNA:t kunnat vara längre än det beräknade värdet?
Problem jag har med detta är dock, hur kan vi veta att detta är hela DNA-sekvensen längd, borde det inte vara möjligt att flera DNA-sekvenser med samma längd hamnar på samma band, borde detta inte i sin tur öppna möjligheten till att ursprungs DNA:t kunnat vara längre än det beräknade värdet?
Restriktionsenzym är en typ av nukleas, där varje restriktionsenzym känner igen en unik DNA sekvens (restriction sites på engelska, motsvarande igenkänningssekvenser på svenska) och kan klyva fosfodiesterbindningarna på bägge strängarna. Vilken sekvensen är och hur klyvningsprodukterna ser ut skiljer sig mellan nukleasen, ett exempel nedan från nukleaset EcoRI från E. coli som känner igen hela sekvensen och klyver den övre strängen mellan G och AATTC, och den undre mellan CTTAA och G (lite överkurs men detta ger ett överhäng som är palindromt).
Om det finns mer än ett restriction site i "hela DNA-sekvensen" så kommer enzymet att klippa flera gånger, tills samtliga är klyvda. Finns det tre sites så klipper just detta restriktionsenzym tre gånger o.s.v., så i princip kan flera klyvningsprodukter resultera i band med samma storlek, men detta gäller f.f.a. mindre band (då de är till slut inte kan klyvas mer, inga oklyvna sekvenser finns kvar).
Men med lite list så går detta att komma runt och den totala storleken (eller längden) av ursprungs-DNA kan listas ut.
Hoppas er lärare passade på att köra en till gel med det oklyvet DNA bredvid klyvet, så ni kan få se skillnaden.
Vänta vad menar du med lite list, hur tänkte du att man löser det?
Lite list, det är inte ett biologibegrepp, mag menar bara med lite extra tänk.
Angående din tanke så nej, det kan den antaligen inte. Din lärare har nog tänkt på det innan och placerat ut restriktionssiten smart så att inga fragment har samma längd.
Tack så mycket, då förstår jag. Det är i labben så är det högst otrovärdigt men det är teoretiskt möjligt.
Aa exakt, det är också en smart sak att nämna i labbrapporten, om ni ska skriva en sån, bara för att låta läraren veta att du vet.
Jag har en fråga till mag också, tror du läraren även valt ett restriktionsenzym för att cutta blunt istället för sticky ends? Kan fragment sätta ihop sig när det finns reducerande SDS i provet?
Jag har en fråga till mag också, tror du läraren även valt ett restriktionsenzym för att cutta blunt istället för sticky ends?
Ingen aning. Men så länge klyvningen inte ger flera fragment med precis samma storlek så spelar det inte någon roll, det går att pussla ihop fragmenten ändå.
Kan fragment sätta ihop sig när det finns reducerande SDS i provet?
Fragmenten kan hybridisera (eller anneal på kloningsengelska), om de har komplementära överhäng (s.k. sticky ends). Men överhängen är ett fåtal baspar, som fyra i exemplet i denna tråd - så att få en stabil hybridisering är osannolikt (då bindningsenergin mellan fragmenten är låg). Om endast ett restriktionsenzym används, får alla fragment samma överhäng och kan teoretiskt hybridisera till en ända lång sträng - men en sådan samling DNA-fragment håller inte ihop i provröret (därför löser naturen det genom att se till att fragmenten sitter ihop med fosofodiesterbindingarna).
Menar du natriumdodekylsulfat med SDS? Den kan tillsättas som detergent, men kan inte reducera (som t.ex. DTT vid SDS-PAGE).
