Fluorescens vs absorbans för proteinanalys
Hej, jag har frågan:
Varför är flourescens generellt en känsligare metod jämfört med absorbansmätning?
Jag vet vad det rätta svaret är, men jag vill bekräfta att följande inte är en giltig anledning:
Det kan finnas annat i lösningen som absorberar vid samma våglängd som målproteinet, dvs det finns bakgrund.
Jag tycker att det är fel för att man ändå nollar med lösningsmedlet innan?
Det kan finnas annat i lösningen som absorberar vid samma våglängd som målproteinet, dvs det finns bakgrund.
Om detta "annat" även absorberar kan det blankas bort (så länge det som är "annat" går att återskapa exakt). Finns detta "annat" med i t.ex. bufferten går det enkelt att välja bort den absorberande substansen till förmån för en med motsvarande kemiska egenskaper, fast utan absorbansen.
Jag tycker att det är fel för att man ändå nollar med lösningsmedlet innan?
Även om du nollar med lösningsmedlet (eller oftare bufferlösningen, lösningsmedel brukar proteinkemiskt vara reserverat för organiska lösningsmedel, som proteiner generellt ogillar) så skiljer sig fluorescens och absorbans mycket åt rent spektroskopiskt.
Absorbansen beräknas ju från den uppmätta transmittansen, och är en summa av alla partiklar i kyvetten som minskar transmittansen vid just den valda våglängden.
Fluorescensen å andra sidan utnyttjar excitation/emission - hur kan det påverka känsligheten?
(eller oftare bufferlösningen,
Ja, jag menade det.
Direkt från facit så står det att excitation/emission är mer känsligt helt enkelt för att man skickar och detekterar olika våglängder, medan vid absorbans är det samma.
Jag tror inte du svarar på min fråga, är "Det kan finnas annat i lösningen som absorberar vid samma våglängd som målproteinet, dvs det finns bakgrund" en ogiltig motivation till det som påstås i frågan?
Direkt från facit så står det att excitation/emission är mer känsligt helt enkelt för att man skickar och detekterar olika våglängder, medan vid absorbans är det samma.
Detta var vad jag åsyftade.
Jag tror inte du svarar på min fråga, är "Det kan finnas annat i lösningen som absorberar vid samma våglängd som målproteinet, dvs det finns bakgrund" en ogiltig motivation till det som påstås i frågan?
Okej, hur skulle det göra fluorescens mer känsligt än absorbans?
Menar du kanske att absorbansbestämningen blir mindre känsligt p.g.a. att det finns "annat" som minskar transmittansen, och att fluorescensen inte påverkas på detta vis?
