Enzymkinetik - labb med surt fosfatas
Hej!
Jag sitter och försöker skriva en labbrapport på en labb vi inte kunnat genomföra p.g.a. distansstudierna och har svårt att förstå teorin bakom allt när vi inte kunnat ha riktig genomgång och fått en chans att ställa frågorna så fort dom kommer upp i huvudet. Därför vänder jag mig nu till er här för lite hjälp :)
Labben går ut på att bestämma Km och kcat för enzymet surt fosfatas m.h.a. spektrofotometrisk analys av hydrolysen av p-nitrofenylfosfat. I en reaktionsserie med sex provrör finns olika volymer av pNPP + citratbuffert och avjoniserat vatten så att totalvolym blir 4,5 ml. Enzymet späds 10 gånger med BSA-lösning och 0,5 ml enzymlösning pipetteras sedan över till varje reaktionsrör. Därefter följs ett tidsschema och prov tas ur rören för att föras över till en mätningsserie om 18 rör, det är alltså en slutpunktsanalys det handlar om.
Så, till min fråga: När jag har kommit så långt att jag ska räkna ut produktkoncentrationen från absorbansvärdena står det i handledningen att vi ska beakta spädningsfaktorn (x6), men jag förstår inte riktigt varför. Antagligen jättelätt men min hjärta snurrar ihop allt och gör det krångligt för mig :) Har jag förstått rätt då om jag räknar ut koncentrationen med Lambert-Beers lag och sedan tar det värdet gånger 6?
Ursäkta för långt och halvdåligt formulerat, hoppas det ändå går att förstå vad jag menar och undrar över!
Därefter följs ett tidsschema och prov tas ur rören för att föras över till en mätningsserie om 18 rör, det är alltså en slutpunktsanalys det handlar om.
Tog ni alltså ut 18 prover vid olika tillfällen, mätte absorbansen och räknade ut koncentrationen av produkten vid de tillfällen då prover togs ut? Eller tolkar jag det fel? Spädde ni proverna innan ni mätte absorbansen?
Vi tog ut 18 prov med två minuters fördröjning mellan varje och förde över dem till rören i mätningsserien där det redan fanns 5 ml NaOH (glömde säga det...). I dessa rör mättes sedan absorbansen och produktbildningen kunde beräknas eftersom reaktionen avstannar i alkalisk miljö. Det är svårt att förklara bara såhär men vid absorbansmätningarna hade vi alltså tre mätningsrör för varje reaktionsrör, ett där provet togs ut efter bara 1 minut, ett efter 10 min och ett efter 20 minuter.
Då gör jag samma tolkning som du, dvs att halten är sex gånger högre än det du får ut genom mätningen i spektrofotometern.
