Enzymaktiviteten
Jag har fått en labinstruktion (ska ej göra labben) men ska göra det teoretiskt och då har jag en fråga om enzym-assayen. Hur ska jag redovisa enzymaktiviteten?
Här kommer själva experimentet i sammandrag:
De immobiliserade enzymet på membran och sen tillförde substratlösningen kontinuerligt genom membranet med en slags pump i 10 min i hastigheten 1ml/min i ett cirkulärt system. Mängden substrat i lösningen var 1mM. Sen togs prover varje minut så 10 prover har vi. För varje provtagning så kördes provet i spektrofotometer och då fick vi en absorbans för varje prov.
Så det har jag har är
-Substratkoncentrationen
-Produktkoncentrationen (uträknad från Beer Lamberts ekvation från absorbansen)
Hur ska jag redovisa det här? Ska jag göra någon ytterligare uträkning? Står bara i uppgiften att jag ska "göra uträkningar och sedan redovisa enzymaktiviteten". Räcker det att jag redovisar produktkoncentrationen och att det visar på enzymets aktivitet?
Tack på förhand!
Lamberts ekvation kan du använda som beräkning för det det själv skriver också. Du har ju gjort 10 prover och fått ut deras absorbansvärden, ett värde i minuten tog ni ut. Då har du en förändringshastighet du kan uttrycka det med, hastighet är ju hur något förändras med tiden. Dina absorbansvärden(koncentration) ändras varje minut eller hur? På din graf kan du plotta ut alla punkter du fått med (x-axel(tid), y-axel(absorbansen eller koncentrationen)) och koppla ihop punkterna med en linje till en kurva. Kurvan kan du ta ut med:
Vet inte riktigt vad ni skulle undersöka och svara på om enzymaktiviteten, men antingen så har ni tagit 10 prover av identiska mängder substrat m.m. och försöka få ut ungefär samma absorbans(koncentrationer) eller samma ökning av den varje gång så ni skulle kunna ha ett medelvärde över hur snabbt produkten bildas. Då får du bara en rät lutning i en graf.
Eller så har ni olika mängder substrat m.m. och ser att mängden substrat ni har i proven gör att absorbansen ökar/sjunker vilket skulle kunna bevisa att enzymaktiviteten beror på mängden substrat i provet och rita en graf som visar det.
Fast är substratkoncentrationen densamma? Eftersom inlet och outlet går i substratlösningen så blir väl substratet förbrukat av enzymet och då minskar koncentrationen av substrat?
Hur visar jag det här? Kan jag räkna ut minskandet av substratkoncentrationen på något vis?
Det är förmodligen varierande. Du skrev att ni pumpa in 1mM substrat kontinuerligt så jag antog ni gjorde det för att hålla substratmängden konstant ungefär under alla prov, isåfall beror inte reaktionshastigheten av enzymet på mängden substrat eftersom om den var lika så ska ni ha fått samma absorbans värde hela tiden med självklarheten att lika mycket enzymer fanns i i alla prov också.
Men om en molekyl av substratet katalyseras av enzymet så omvandlas ju substratet till 1 molekyl av produkten, så med absorbansen för produkterna ni fick så innebär det att om 8139939 µmol eller 34229 µmol... vilket mängd som helst produkt, spelar ingen roll, så har dessa omvandlats från precis lika mängd substrat. Därför går det bra att mäta mängden produkt eller mängden substrat kvar efter en tid reaktionen pågått.
Därför som svar på frågan om man kan beräkna minskandet av substratkoncentrationen, om du nu vet startkoncentrationen av den för varje prov så kan du beräkna den, då tar du skillnaden i startkoncentration substrat och koncentrationen bildad produkt(från samma mängd substrat) och ser hur mycket av substratet som reagerade.
Annars har du ju mätt Absorbansen mot tiden som du kan överföra till en graf. Absorbansen blir förmodligen högre för varje gång så då kan du antingen få ut koncentrationen av absorberande ämnet via beers lag eller så tar du (x2-x1/y2-y1) punkterna av grafen och får ut lutning mellan just dom 2 punkterna och så gör du så för alla punkter och tar medelvärdet.
