ELISA för detektion av antikropp mot protein hos Plasmodium falciparum
Hej, se:
Ni har upptäckt att patienter med malaria har antikroppar i blodet som är riktade mot ett specifikt protein (MSP-1) på parasiten Plasmodium falciparum. Ni vill nu utveckla en ELISA-baserad metod för att diagnostisera malaria-patienter genom att detektera dessa antikroppar från blodprov. Beskriv kortfattat (inkludera gärna en figur) hur ni skulle designa ELISA-metoden. Ge även förslag på två lämpliga negativa kontroller och en positiv kontroll för er metod samt ange vad kontrollerna ger för information.
Jag svarar:
- För att inte behöva rena så utgår vi från blodserum vilket är komplext. Indirekt ELISA lämpar sig bäst till att detektera ab i blodprov (även sandwich skulle funkat).
- Tillvägagångssättet är att först immobilisera MSP-1 i brunnarna, sedan tillsätta blodprov och sedan sekundär inmärkt antikropp.
- En negativ kontroll kan vara att följa instruktionerna men hoppa över blodprovet, på så sätt kan vi säkerställa att den sekundära antirkoppen inte kan direkt binda MSP-1 (om den kan det så ger experimentet falska positiva resultat).
- En annan negativ kontroll kan vara att ta blodprov från en patient man vet aldrig har haft malaria, då vet vi att ingen annan i blodet vanligt förekommande AB kan binda MSP-1.
- En positiv kontroll kan vara att rena fram och tillsätta prov med anti-MSP-1, detta förväntas ge positivt resultat. Om den inte gör det är det något fel med antigenet eller dess immobilisering, eller fel på den sekundära antikroppen. (minskar falska negativa).
Ser det bra ut?
Qetsiyah skrev:Hej, se:
Ni har upptäckt att patienter med malaria har antikroppar i blodet som är riktade mot ett specifikt protein (MSP-1) på parasiten Plasmodium falciparum. Ni vill nu utveckla en ELISA-baserad metod för att diagnostisera malaria-patienter genom att detektera dessa antikroppar från blodprov. Beskriv kortfattat (inkludera gärna en figur) hur ni skulle designa ELISA-metoden. Ge även förslag på två lämpliga negativa kontroller och en positiv kontroll för er metod samt ange vad kontrollerna ger för information.
Jag svarar:
- För att inte behöva rena så utgår vi från blodserum vilket är komplext. Indirekt ELISA lämpar sig bäst till att detektera ab i blodprov (även sandwich skulle funkat).
Varför skulle sandwich vara bra? Med sandwich tappas ju vinsten (selektiviteten/känsligheten) med den sekundära antikroppen från indirekt-ELISA.
- Tillvägagångssättet är att först immobilisera MSP-1 i brunnarna, sedan tillsätta blodprov och sedan sekundär inmärkt antikropp.
Organism för sekundära antikroppen, och dess specificietet kanske du vill kommentera.
Blockera brunnarna efter detta kanske, för vad skulle ske om du inte blockerade?
- En negativ kontroll kan vara att följa instruktionerna men hoppa över blodprovet, på så sätt kan vi säkerställa att den sekundära antirkoppen inte kan direkt binda MSP-1 (om den kan det så ger experimentet falska positiva resultat).
Okej, men vad tänker du tillsätta istället för den sekundära antikroppen? Annars blir det bl.a. en koncentrationsskillnad etcetera.
Denna täcker även att det inte sker någon ospecifik inbinding till plattan, verifiera blockeringen etcetera.
- En annan negativ kontroll kan vara att ta blodprov från en patient man vet aldrig har haft malaria, då vet vi att ingen annan i blodet vanligt förekommande AB kan binda MSP-1.
Denna täcker även att det inte sker någon ospecifik inbinding till plattan, blockeringen etcetera.
- En positiv kontroll kan vara att rena fram och tillsätta prov med anti-MSP-1, detta förväntas ge positivt resultat. Om den inte gör det är det något fel med antigenet eller dess immobilisering, eller fel på den sekundära antikroppen. (minskar falska negativa).
Ser det bra ut?
Detta liknar ett positivt patientprov, men effekter från humant plasma missas, dock är detta upplägg är lätt att göra.
Du har ju redan planerat att tillsätta plasma från en anti-MSP-1 negativ donator, vilket tillsammans med din föreslagna anti-MSP-1 motsvarar ett prov från en anti-MSP-1 positiv patient - kanske ett alternativ.
Varför skulle sandwich vara bra? Med sandwich tappas ju vinsten (selektiviteten/känsligheten) med den sekundära antikroppen från indirekt-ELISA.
Åh jag tar tillbaka det haha
Organism för sekundära antikroppen, och dess specificietet kanske du vill kommentera.
Blockera brunnarna efter detta kanske, för vad skulle ske om du inte blockerade?
Jag tänkte göra en annan tråd om det här. Vad är det egentligen för antikroppar som binder ospecifikt till andra antikroppas Fc region? Jag vet om proteinet som kallas Protein A, men det är ingen Ab. Produktionsorganismen för den sekundära antikroppen... Helst människoceller men det är svårt och dyrt, så kanske svamp?
Okej, men vad tänker du tillsätta istället för den sekundära antikroppen? Annars blir det bl.a. en koncentrationsskillnad etcetera.
Denna täcker även att det inte sker någon ospecifik inbinding till plattan, verifiera blockeringen etcetera.
Du menar istället för serumet? Kanske... samma buffertlösning som sekundärantikroppen?
Detta liknar ett positivt patientprov, men effekter från humant plasma missas, dock är detta upplägg är lätt att göra.Du har ju redan planerat att tillsätta plasma från en anti-MSP-1 negativ donator, vilket tillsammans med din föreslagna anti-MSP-1 motsvarar ett prov från en anti-MSP-1 positiv patient - kanske ett alternativ.
Oj, du menar att jag renar fram anti-MSP1 och tillsätter det till anti-MSP1 negativt blodserum för att närmare efterlikna blodserum? Medan jag föreslog ett rent prov med anti-MSP1.
Vilka effekter från humant plasma tänker du på? Jag vet att det är dåligt eftersom posititva/negativa kontroller ska likna originalexperimentet så nära som möjligt, men var det något speciellt du tänkte på?
Organism för sekundära antikroppen, och dess specificietet kanske du vill kommentera.
Blockera brunnarna efter detta kanske, för vad skulle ske om du inte blockerade?
Jag tänkte göra en annan tråd om det här. Vad är det egentligen för antikroppar som binder ospecifikt till andra antikroppas Fc region? Jag vet om proteinet som kallas Protein A, men det är ingen Ab. Produktionsorganismen för den sekundära antikroppen... Helst människoceller men det är svårt och dyrt, så kanske svamp?
Den primära antikroppen (Ab1) kan komma från vilken organism som helst, och den sekundära antikroppen (Ab2) med - men den sekundära behöver vara artmatchad till den första. Detta då antikropparna skiljer sig lite åt, även mellan närbesläktade arter (p.g.a. olika sekvens, glykosylering etcetera).
Är din Ab1 från mus behöver din Ab2 från t.ex. get, vara just anti-mus. Den sekundära Ab2 behöver vara skapad genom t.ex. immunisering med just mus-antikropp (inte specifikt din Ab1, en annan går oftast bra, då de antikroppar som bildas, anti-Ab1, binder till andra delar än Fc regionen).
Cellkultur med mänskliga celler är nog bäst att undvika av de anledningar du nämnde.
Okej, men vad tänker du tillsätta istället för den sekundära antikroppen? Annars blir det bl.a. en koncentrationsskillnad etcetera.
Denna täcker även att det inte sker någon ospecifik inbinding till plattan, verifiera blockeringen etcetera.
Du menar istället för serumet? Kanske... samma buffertlösning som sekundärantikroppen?
Nej inte serumet, mest istället för bufferten som du nämnde. Annars skiljer sig experimenten åt med fler parametrar.
Detta liknar ett positivt patientprov, men effekter från humant plasma missas, dock är detta upplägg är lätt att göra.Du har ju redan planerat att tillsätta plasma från en anti-MSP-1 negativ donator, vilket tillsammans med din föreslagna anti-MSP-1 motsvarar ett prov från en anti-MSP-1 positiv patient - kanske ett alternativ.
Oj, du menar att jag renar fram anti-MSP1 och tillsätter det till anti-MSP1 negativt blodserum för att närmare efterlikna blodserum? Medan jag föreslog ett rent prov med anti-MSP1.
Då tänkte vi nog på samma sak, var inte säker på vad ditt prov var. Du hade ju redan planerat för att använda anti-MSP1 negativt blodserum, så om detta redan "fanns i kylen" var det bara att köra.
Du bör dock nämna att du planerar att blockera brunnarna innan Ab1.
mag1 skrev:
Organism för sekundära antikroppen, och dess specificietet kanske du vill kommentera.
Blockera brunnarna efter detta kanske, för vad skulle ske om du inte blockerade?
Jag tänkte göra en annan tråd om det här. Vad är det egentligen för antikroppar som binder ospecifikt till andra antikroppas Fc region? Jag vet om proteinet som kallas Protein A, men det är ingen Ab. Produktionsorganismen för den sekundära antikroppen... Helst människoceller men det är svårt och dyrt, så kanske svamp?
Den primära antikroppen (Ab1) kan komma från vilken organism som helst, och den sekundära antikroppen (Ab2) med - men den sekundära behöver vara artmatchad till den första. Detta då antikropparna skiljer sig lite åt, även mellan närbesläktade arter (p.g.a. olika sekvens, glykosylering etcetera).
Är din Ab1 från mus behöver din Ab2 från t.ex. get, vara just anti-mus. Den sekundära Ab2 behöver vara skapad genom t.ex. immunisering med just mus-antikropp (inte specifikt din Ab1, en annan går oftast bra, då de antikroppar som bildas, anti-Ab1, binder till andra delar än Fc regionen).
Cellkultur med mänskliga celler är nog bäst att undvika av de anledningar du nämnde.
Okej!
Okej, men vad tänker du tillsätta istället för den sekundära antikroppen? Annars blir det bl.a. en koncentrationsskillnad etcetera.
Denna täcker även att det inte sker någon ospecifik inbinding till plattan, verifiera blockeringen etcetera.
Du menar istället för serumet? Kanske... samma buffertlösning som sekundärantikroppen?
Nej inte serumet, mest istället för bufferten som du nämnde. Annars skiljer sig experimenten åt med fler parametrar.
Okej!
Detta liknar ett positivt patientprov, men effekter från humant plasma missas, dock är detta upplägg är lätt att göra.Du har ju redan planerat att tillsätta plasma från en anti-MSP-1 negativ donator, vilket tillsammans med din föreslagna anti-MSP-1 motsvarar ett prov från en anti-MSP-1 positiv patient - kanske ett alternativ.
Oj, du menar att jag renar fram anti-MSP1 och tillsätter det till anti-MSP1 negativt blodserum för att närmare efterlikna blodserum? Medan jag föreslog ett rent prov med anti-MSP1.
Då tänkte vi nog på samma sak, var inte säker på vad ditt prov var. Du hade ju redan planerat för att använda anti-MSP1 negativt blodserum, så om detta redan "fanns i kylen" var det bara att köra.
Du bör dock nämna att du planerar att blockera brunnarna innan Ab1.
Ja det har du rätt i.
