DNA extraktion ur ärtor - tips?
Jag ska tydligen kunna fiska upp dna:t med en pinne men det går inte. Det blir inte heller några långa trådar utav det, bara moln. :/
Är det någon som har några tips på hur man kan förbättra resultatet? Det här var mitt fjärde försök och det börjar kännas jobbigt med allt svinn av ärtor, diskmedel och t-röd.
Utförande:
Koka ärtor enligt anvisningar på paket. Mosa ärtorna. Blanda med 60ml vatten, 10ml diskmedel och 1/4 tsk salt. Filtrera genom kaffefilter. Häll lika mycket iskall etanol som vätska. Plocka upp dnat med pinne.
Kan nämna att jag i mina försök har testat både att låta de koka på plattan, låta de ligga i kokvattnet (utan att det kokar). Jag har mosat försiktigt med skeden, och mosat så att det blir en smet. Jag har rört försiktigt med salt och diskmedlet och rört kraftfullt så att det bubblade ordentligt. Samma resultat.
För sen ska vi skicka in en bild på det med labbrapporten.
Det fluffiga vita du ser är ärtornas DNA som klumpat ihop sig, förmodligen för att vätskorna blandats i hop för mycket.
Det går att få fram DNA och sedan med t.ex. en tandpetare dra upp DNA som en tunn, tunn sträng. Kruxet är att DNA:t lika gärna kan klumpa ihop sig, om man t.ex. rör runt vätskan efter tillsats av den fryskalla etanolen. Det är vid etanolsteget som risken finns att DNA klumpar ihop sig.
Ett tips för att kunna dra upp DNA i trådar är att, vara försiktig vid tillsatsen av etanolen. Efter att du kokat ärtorna (och därmed sprängt sönder cellerna) så mosar du ärtorna försiktigt. Sedan efter filtreringen får du DNA i vätskan (filtratet). Nu kommer vi till etanolen. När du häller på etanolen försökt att göra det långsamt och försiktigt. I bästa fall kan du få etanolen att hamna som ett eget lager ovanpå fitratet, och DNA kommer då falla ut ur filtratet (nedan) och lägga sig som en tunn hinna i gränsskiktet mellan filtratet och etanolen (överst, har lägre densitet än filtratet).
Och stoppar du nu försiktigt ner en tandpetare eller ätpinne ner igenom gränsskiktet - så borde du kunna försiktigt dra upp DNA som en sträng. Vispar du istället om med pinnen kommer DNA att klumpa ihop sig, som i din bild.
Knepet för att kunna få två skikt är att ha etanolen kall (låt den stå i frysens -20°C några timmar), och fram för allt när du tillsätter den låt den långsamt rinna ner på ytan av filtratet, längs t.ex. en sked. Du skall alltså inte hälla i etanolen, utan försöka långsamt få etanolen att lägga sig ovanpå filtratet.
Lyckas du med detta får du två olika faser, genom etanolens lägre densitet och vätskornas temperaturskillnad. Ren etanol blandar sig inte direkt med fitratet, men vätskorna går så klart att blanda. Anledningen till att de inte blandas direkt är att det går åt en del energi att blanda om den koncentrerade etanolen med filtratet, samt att vätskornas olika temperatur gör att de inte spontant blandar sig. Men om du häller i etanolen lite häftigare kommer vätskorna blandas om mer - och det blir mer turbulens i vätskorna, med risken att DNA klumpar ihop sig.
Detta är samma princip som när olika drycker med olika lager görs (t.ex. "stacked cocktails" ), som i bilden nedan där den översta vätskan försiktigt hälls ned på skeden och på så vis, fås olika lager av vätskor.
Så det är detta knepet med skeden som kan ge dig den tunna hinnan med DNA mellan vätskorna. Och ur denna hinna kan du dra upp DNA i en sträng, istället för de fluffiga bollarna du sett.
