Design av primer för att introducera en aminosyra
Har lite problem med denna fråga:
Ett avgörande steg i vaccinutvecklingen mot COVID-19 var att generera stabiliserade former av antigenet, det så kallade spikeproteinet, vilket är instabilt i sin naturliga form. En forskare på ett bioteknikföretag har fått i uppgift att stabilisera spikeproteinet genom att designa en primer som introducerar en cystein, med så få ändringar (mutationer) i DNA sekvensen nedan som möjligt (sekvensen svarar mot en kort peptid av spikeproteinet). Vilken primer ska forskaren använda för att åstadkomma detta? Ange primersekvensen i 5’- till 3’- riktning. Motivera ditt svarkortfattat. Använd schemat som stöd.
DNA sekvens: 5’-TAATGTTCATCTAG-3’
Jag vet att man antingen ska lägga in UGU eller UGC (mRNA) vilket borde bli TGT eller TGC i primer sekvensen. Men Jag hur man ska skriva den för att det ska bli "så få mutationer som möjligt" i DNA.
Tripletterna i mRNA som kodar för cystein består, som du var inne på, av tre nukleotidbaser. Och för att introducera någon av de två tripletterna så behöver du mutera sekvensen i primer, precis som det står i uppgiften.
Du behöver bara lista ut var i sekvensen du kan mutera in en cystein - men med så få förändringar som möjligt i sekvensen.
Efterssom det första kodonet är ett stop kodon (UAA) så tänker jag att man kan ersätta den med ett cystein kodon som TGT. Då blir hela primersekvensen 5'-TGTTGTTCATCTAG-3'. Tänker jag rätt då, efterssom ingen aminosyra togs bort från sekvensen?
Nja, du tänker på rätt vis, men med lite felaktiga utgångspunkter.
Det framgår inte i uppgiften (eller i.a.f. Inte i ditt inlägg) i vilken läsram sekvensen är. Oavsett blir det ju underligt om du planerar att ersätta ett stopkodon med en cystein, då det ger en förändring av läsramen (som kommer resultera i en förändrad produkt).
Om du även tänker på läsramen, samt kanske en motivation till valet av den läsramen - vilken/vilka mutationer primersekvensen kan du skapa?
Okej, nu såg jag att läsramen inte blir hel då den slutar med två enskilda nuklletider (AG). Så är det kanske där man ska lägga in mutationen genom att byta ut dessa till TGT? Då blir primern 5’-TAATGTTCATCTTGT-3’
Fausto skrev:Okej, nu såg jag att läsramen inte blir hel då den slutar med två enskilda nuklletider (AG).
Ja precis, resultatet av hela sekvensen är det som är viktigt att hålla i minnet - för en fråga likt din kan du inte utgå ifrån en läsram som innehåller ett stoppkodon. Hela sekvensen och sammanhanget påverkar m.a.o.
I frågan står det "i sekvensen", d.v.s. det framgår inte vilken del av genen som denna sekvens motsvarar.
Så är det kanske där man ska lägga in mutationen genom att byta ut dessa till TGT? Då blir primern 5’-TAATGTTCATCTTGT-3’
Vilken aminosyrasekvens får du då från DNA-sekvensen?
Eftersom hela sekvensen påverkar behöver du translatera sekvensen och se efter om det överhuvud taget går. Och du behöver så klart även jämföra med sekvensen i uppgiften - så att den enda skillnaden i aminosyrasekvensen som uppstår är att en aminosyra muteras till en cystein.
Sekvensen blir väl då:
Cys-Ser-Ser-Cys
Om man inte tar med stoppkodonnet, vilket är samma som DNA sekvensen förutom Cys som läggs till i slutet.
Fast om du planerar med stopkodonet där, först i sekevensen, så avstannar ju allt vid stopkodonet. Ingen av sekvensen nedströms om stopkodonet kommer translateras. Och det löser ju inte "uppdraget" i frågan.
Läsramen påverkar ju vad sekvensen i uppgiften ger för resultat. Det första kodonet kan vara antingen:
TAA, d.v.s. ett stopkodon - allt nedströms om detta transkriberas ej.
första tripletten är AAT, d.v.s läsramen är förskjuten +1
första tripletten är ATG, d.v.s läsramen är förskjuten +2
Det beror lite på hur lurig du tror frågan är. Det "enklaste" svaret är mutera stopkodonet till TGT/C, d.v.s. två baser muteras - men då har du sabbat sekvensen i genen, genom att stopkodonet tas bort.
Så jag skulle undersöka de två andra läsramarna och se efter hur många samtidiga mutationer du behöver göra för att introducera en cystein.
Eftersom läsramen inte är angiven tycker jag du borde kunna välja fritt mellan +1 och +2 i läsramen.
Ett tips som kan göra det enklare är att bryta upp sekvensen till tripletter, det kan vara enklare att få en överblick på så vis. Motsvarande:
5’- TAA TGT TCA TCT AG -3’
Okej så om man förskjuter läsramen i sekvensen till +2 så får man denna sekvens:
5' - TA ATG TTC ATC TAG -3'
Då då får man ett stopkodon i slutet av sekvensken istället. Därför tänker jag att man bara byter ut de två första (TA) till TGT. Förstår jag rätt då?
Ja det skulle vara ett sätt att lösa uppgiften. Dubbelkolla bara om det går att lösa uppgiften med ännu färre mutationer i denna +2 läsram. Du kommer behöva motivera varför du valde detta sätt, så du behöver nog undersöka hur det ser ut i +1 läsramen - kanske det är bättre eller i.a.f. annorlunda.
Ok då fattar jag, tack så mycket för hjälpen!
