Checka mina svar: antikroppsbaserade analysmetoder

Qetsiyah skrev:

Hej,

Ni ska klona, producera och direktinmärka ett litet affinitetsprotein med en fluorofor. Affinitetsproteinet har många lysiner, men inga cysteiner. Beskriv er strategi för kloning och inmärkning och motivera.

Om fluoroforen är ett protein kan vi fusera den, det är bättre än kovalent direktinmärkning eftersom den kanske binder in i paratopen vilket vi absolut inte vill. Om den inte är ett protein så använder vi lysinerna och binder via amidbindning.

Men om du skapar ett proteinkonstrukt med affinitetsproteinet tillsammas med en proteinfluorofor kan du väl inte direktinmärka affinitetsproteinet? Ditt svar är lite utanför lådan, men låter inte som det eftersökta.

Konjugeringen till amingruppen på Lys låter bra, men du borde kanske fundera på motiveringen till varför. Frånsett att det går att göra så. Att det finns många Lys-rester i detta fall kan vara positivt (tänk bevarande av epitop).

 

Ge ett exempel när det skulle vara nödvändigt att använda en kompetitiv ELISA istället för en sandwich-ELISA.

Vid sandwich behövs (minst) två epitoper på antigenet. Om den är liten är det inte alls säkert att den har det.

Men vid konkurrerande ELISA används ju också två antikroppar, som kan känna igen samma eller olika epitoper.

Denna metod kan som de andra ELISA metoderna varieras, t.ex. Ab eller Ag kan bindas in till plattan, så Ag/Ab kan detekteras i provet.

Vad finns det för ”krav” på de antikroppar som används i en Sandwich ELISA?

De måste binda till olika epitoper på antigenet.

Ja, den fångande och detekterande antikroppen behöver ha olika epitoper.

---

På fråga 2 och 3 är jag säker på att svaret är rätt, men jag vet inte om min lärare fiskar efter något mer...

1. Oj, jag glömde. Så som vi har gått igenom på föreläsningar är det underförstått vid "direkt inmärkning" att det inte är en proteinfluorofor. Det är bra med många Lys för att då minskar risken för att den sätter sig på paratopen? (Du skrev epitopen?)
2. Jag förståer inte vad du menar... Här står det "It is also suitable for detecting small antigens that cannot be bound by two different antibodies such as in the sandwich ELISA technique." vilket var det jag försökte skriva, är det inte rätt?

EDIT: jag glömde länka, här: https://www.bio-rad-antibodies.com/elisa-types-direct-indirect-sandwich-competition-elisa-formats.html#5

Qetsiyah skrev:

1. Oj, jag glömde. Så som vi har gått igenom på föreläsningar är det underförstått vid "direkt inmärkning" att det inte är en proteinfluorofor. Det är bra med många Lys för att då minskar risken för att den sätter sig på paratopen? (Du skrev epitopen?)

Ja så klart var det paratopen jag menade. Och ja risken är mindre att just paratopen modifieras, speciellt då fluoroforen inbindningen blir heterogen. Det kommer med andra ord finnas flera olika populationer av affinitetsproteinet, beroende på att fluoroforen sitter på olika Lys-rester - så några av dessa populationer kommer sannolikt inte att ha fluoroforen på just paratopen.

2. Jag förståer inte vad du menar... Här står det "It is also suitable for detecting small antigens that cannot be bound by two different antibodies such as in the sandwich ELISA technique." vilket var det jag försökte skriva, är det inte rätt?

Jo det stämmer, men det finns andra fördelar - det är t.ex. möjligt att koncentrationsbestämma mängden Ab eller Ag direkt från t.ex. serum, där signalen släcks ut ju högre koncentrationen av Ab/Ag är.

1. Ah, det hade jag inte tänkt på, heterogena och homogena antikroppar.
2. Genom att skicka in mikroliterplattan i spektrofotometer?

Qetsiyah skrev:

1. Ah, det hade jag inte tänkt på, heterogena och homogena antikroppar.

I avseende på var fluoroforen sitter ja. Denna effekt går så klart att få både på mono- och polyklonala antikroppar.

Genom att skicka in mikroliterplattan i spektrofotometer?

Så gott som all ELISA görs med en platta och spektrofotometer. Genom att variera koncentrationen av Ab/Ag i plattan eller späda serumet stegvis kan koncentrationen av t.ex. en antikropp i serum bestämmas.

Okej, jag har inga fler frågetecken, tack!