Checka mina svar: affinitetsrening

Hej, här är frågorna:

1. Du ska uttrycka och rena ett stort enzym, Aktase. Aktase har en relativt känslig struktur som är beroende av saltbryggor som förstörs vid pH under 5, eller om det är hög koncentration av salt. Det aktiva sätet sitter i N-terminala änden, där den primära aminen behöver vara fri för att ge aktivitet.Välj en reningstag för att lättare kunna få fram rent och aktivt Aktase. Motivera ditt val!
2. Beskriv de slags interaktioner som används i affinitetskromatografi.
3. Beskriv två av de olika elueringstrategier som kan användas i affinitetsrening.
4. Hur funkar kovalent kromatografi, och varför är det svårt att genomföra i praktiken?

Jag svarar:

1. Reningstaggen ska sitta på C-terminal, den behöver inte vara särskilt liten. Taggen ska kunna elueras helst utan varken salt eller pH (bra att vara försiktig även om det går att göra enligt frågan). Jag väljer därför His6 taggen eftersom den elueras genom tillsats av imidazole, kompetitiv eluering.
2. Att två molekyler har passande makro-passform för att binda till varandra. I termer av kemiska intermolekylära bindingar kan alla sorters interaktioner bidra, hydrofob/hydrofil interaktion, vätebindning, saltbryggor. Kovalent finns också men är ovanligt i reningssammanhang.
3. Kompetitiv eluering, eller att störa interaktionerna på olika sätt. Interatkionerna kan störas med pH (påverkar maktrostruktur), tillsats av salt (stör saltbryggor), ändra polaritet hos bufferten (stör hydrofoba interaktioner).
4. Inbindningen mellan ligand och målprotein sker kovalent. Det binder hårt så att man kan tvätta bort skräp effektivt. Problemet är bara elueringen, ingen av ovanstående strategier skulle fungera, vi behöver bryta kovalenta bindnignar. Det är svårt att göra specifikt, och det kan förstöra proteinet.