Centrifugering - framrening
Del av instruktion till en labb.
"Börja med att tillsätta 40 ml 0,3 % aluminiumsulfat till 10 g malet kohjärta och skaka
falconröret. Häll sedan i provet i mixern, alla gruppernas prover hälls i och mixas i 3x30
sekunder. Häll sedan upp 40 ml av lösningen i ett nytt falconrör och kontrollera att pH
ligger runt 4,5. Justera med 5 % aluminiumsulfatlösning vid behov. Låt provet stå i
kylskåp i ca 10 minuter (eller tills alla grupper har mätt pH).
Separation av proteiner från cellrester och fetter
Centrifugera rören i 10 minuter, 3500 rpm vid 4°C. Häll av och filtrera supernatanten
genom en tratt med en ”tuss” glasull i. Använd 1,25 % ammoniak för att justera pH till
8,4.
Centrifugera proverna i 15 minuter, 3500 rpm vid 4°C. Häll över supernatanten i en 100
ml bägare och använd 5 % aluminiumsulfatlösning för att justera pH till 8."
1) är inte en vanliga hushållsmixer för ... "stor-knivad" för att sönderdela celler?(??)
2) Man centrifugerar och höjer sedan pH i supernatanten (man har hällt den genom glasull så fettrester som flyter försvinner samt utfällda proteiner och celldelar har slängts med pelleten, som blir efter centrifugeringen).
Nu är frågan varför man först går till 8,4 och sedan till 8 - speciellt går man i steg 2 till ett värde som ju i princip är det första (!)?
Jag kan inte komma på det. Jag har tänkt på att olika oönskade molekylers pI kan göra de fälls ut om man går till visst pH. Men dessa ligger så nära.
Hint?
1) Jo, den söderdelar inte celler, utan varför behövs dessa knivar?
2) I vilket skede sänks pH, och vilket är nästa steg? Varför är det bra att pH är lägre vid detta steg, vad händer med materialets olika delar?
Och samma tanke gällande att pH höjs till 8,4, varför/vad sker efter?
Slutligen sätts pH till 8.0, varför tror du, vad sker senare?
1) jag kommer faktiskt inte på det. Eller alltså, det blev en jämnare "soppa" men mer än så? I nästa steg så centrifugeras mixen och man får en pellet med cellDELAR samt utfällda proteiner. Är det centrifugeringen som öppnar upp cellerna?
2) pH sänks i första steget, vid Aluminiumsulfattillsättningen (pH låg på ca 5,5 efter första centrifugeringen och då var det bara hjärta och aluminiumsulfat i lösningen).
Protonerade fosfolipider / mindre mängd negativ laddning (det senare för jag hittade att inte alla fosfolipider - man har ju på cellmembranet också och inte bar på mitokondriens membran - har ett pKa som är uppåt 7, vissa verkar ha runt 3) gör att fler proteiner på utsidan lossnar.
Men 8,4 - pH höjs dit. De-protoneras fosfolipiderna då? Men vad är fördelen med det, då kan de ju binda upp proteinerna igen?
Att pH är över 8 tänker jag är för man ska sedan hälla lösningen tillsammans med en katjonbytargel med karboxylsyregrupper, vilka jag tänker måste vara deprotonerade för att ha rätt effekt (alltså vara negativt laddade så de kan binda de positivt laddade proteinerna). Samtidigt vill man ha viss marginal så man ligger tillräckligt långt under pI för proteinerna så de verkligen är positivt laddade. Därför går man ner från pH 8,4 ?
Men nej jag greppar INTE detta helt, hur man ska tänka om stegen...
Först en detalj: Du skriver genomgående aluminiumsulfat, men allt i din text tyder på att du har använt ammoniumsulfat. Kolla upp det!
Sedan din fråga: Är det ett enzym du ska rena (helt eller delvis)? Vet du var det befinner sig (i fällning eller i lösning) i de oika lstegen? Justeringarna i pH handlar om att ändra lösligheten för olika proteiner. Att gå upp till pH 8,4 gör att vissa proteiner faller ut. Att gå ner till 8 efter det gör att de som INTE föll ut säkert håller sig lösta (annars skulle man få ”eftersläntrare” som långsamt fortsatte att falla ut).
SvanteR skrev:Först en detalj: Du skriver genomgående aluminiumsulfat, men allt i din text tyder på att du har använt ammoniumsulfat. Kolla upp det!
Sedan din fråga: Är det ett enzym du ska rena (helt eller delvis)? Vet du var det befinner sig (i fällning eller i lösning) i de oika lstegen? Justeringarna i pH handlar om att ändra lösligheten för olika proteiner. Att gå upp till pH 8,4 gör att vissa proteiner faller ut. Att gå ner till 8 efter det gör att de som INTE föll ut säkert håller sig lösta (annars skulle man få ”eftersläntrare” som långsamt fortsatte att falla ut).
Tack för kommentaren. Dock är det aluminiumsulfat det står i handledningen med ett undantag (TACK!): saltet ska vara ammoniumsulfat.
Varför tänkte du det var fel på de andra ställena, eller var det just det du syftade på?
Själv vet jag inte vad det gör - jag vet bara att steget är när vi ska fälla uteventuella orenheter och proteiner efter jonbyteskromatografin. Sulfatjoner är i då. Och NH4^(+). Och pH borde vara runt 8 (inget vi skulle kolla men bufferten vi använder för att "tvätta" gelen är på det pH:t). Men vad som händer...?
Ja, cytokrom C ska renas fram ur malet kohjärta.
Jag tänker det hela tiden befinner sig i supernatanten / lösningen.
Vi mixar hjärta med aluminiumsulfat och sedan centrifugerar det - där det är supernatanten vi häller av och sparar. Ph är då ca 5,5 så molekylen är positivt laddad.
1. En fråga: spelar det någon roll - liksom kan man dra en generell slutsats och i så fall varför - om ett protein är laddat eller neturalt för om det ska falla ut eller om det ska vara löst? Så tex då det jag skrev just ovan om att pH är 4,5 och proteinet är +-laddat : innebär detta att det kommer fälla ut? Vilket jag spontant tänker det borde vara en risk för, att det sätter ihop sig med något positivt. Eller beror det på vad som finns i lösningen?
Sen höjs pH då till runt 8,4 (vi skulle ligga mellan 8-9) och man centrifugerar igen, vilket gör att något faller ut och man igen sparar - efter filtrering för att avlägsna fett som separerat ut vid första centrifugeringen - supernatanten så proteinet måste ju finnas däri.
Filtratets pH sänks till 8.
Men nej, jag förstår inte hur du menade. Varför skulle man inte vilja att "eftersläntrarna" som inte reagerat på pH 8,4 fortsätter att falla ut?
