Cellbiologi/bioteknik

Välkommen till Pluggakuten! Lägg varje fråga i en egen tråd, så blir det mindre rörigt! Behåll fråga ett i denna tråd, och gör nya trådar för de andra frågorna. /moderator 

Då kan jag svara på första frågan här:

Flr det första tycker jag att frågan är konstig för att vektor betyder grejen du använder för att föra över till värdcellen (däggdjurscellerna), i detta fall har du valt att göra det halvnaket dvs med en plasmid.

Jag förstår inte ditt andra steg. Hur ska du splica DNA? Splicing är något man gör på pre-mRNA. Vill du splica DNA?? I tredje steget säger du att du vill översätta RNA till DNA, men du har redan DNA. Det hade varit enklare om du som första steg extraherade total-RNA.

Smart att sätta in flourescensgen innan transfektion! 

Qetsiyah skrev:

Då kan jag svara på första frågan här:

Flr det första tycker jag att frågan är konstig för att vektor betyder grejen du använder för att föra över till värdcellen (däggdjurscellerna), i detta fall har du valt att göra det halvnaket dvs med en plasmid.

Jag förstår inte ditt andra steg. Hur ska du splica DNA? Splicing är något man gör på pre-mRNA. Vill du splica DNA?? I tredje steget säger du att du vill översätta RNA till DNA, men du har redan DNA. Det hade varit enklare om du som första steg extraherade total-RNA.

Smart att sätta in flourescensgen innan transfektion! 

Tror det var tänkt att stå "RNA-extraktion" i början. Och som du skrev vore det bättre att extrahera mRNA istället - vilket är det som brukar användas som RCR-templat för att skapa cDNA av processade (bl.a.) intronfria RNA-transkript.

För delarna under 1. så är det knepigt att veta hur mycket som saknas, då det är väldigt sammanfattat.  För "Tekniker, huvudreagenser/komponenter", finns det massor att skriva om.

Patientprovet kanske kan beskrivas lite mer, vilken vävnad föreslår du att det tas det ifrån och hur?

Som din vektor är beskriven kommer den inte kunna ärvas vidare till de delande cellerna, d.v.s dottercellerna kommer inte ha vektorn - något saknas, kommer du på vad?

Hur skall du verifiera att din kloning (som det heter när DNA "sätts in" i t.ex. en plasmid) faktiskt fungerat?

Hur skall du verifiera att din transfektion faktiskt fungerat?

Loket skrev:

"Plasmiden förs in i däggdjuret med hjälp av electroporation."

Nej det går inte att transformera hela djuret, utan vad transformeras?

Smutstvätt skrev:

Välkommen till Pluggakuten! Lägg varje fråga i en egen tråd, så blir det mindre rörigt! Behåll fråga ett i denna tråd, och gör nya trådar för de andra frågorna. /moderator 

Tack! Uppfattat, då gör jag så :)

Utmärkt!

Qetsiyah skrev:

Då kan jag svara på första frågan här:

Flr det första tycker jag att frågan är konstig för att vektor betyder grejen du använder för att föra över till värdcellen (däggdjurscellerna), i detta fall har du valt att göra det halvnaket dvs med en plasmid.

Jag förstår inte ditt andra steg. Hur ska du splica DNA? Splicing är något man gör på pre-mRNA. Vill du splica DNA?? I tredje steget säger du att du vill översätta RNA till DNA, men du har redan DNA. Det hade varit enklare om du som första steg extraherade total-RNA.

Smart att sätta in flourescensgen innan transfektion! 

Såg inte att jag skrivit RNA-förrän nu, var nog lite trött när jag gjorde tråden. Håller med om att det blir konstigt då. 

Vet inte om det förändrar din frågeställning men detta är kopierat direkt från frågan jag fick:
"För att göra detta behöver du att klona in den muterade beta-globin genen (utan introner) från patienten till en vektor på bilden nedan. Beskriv i punktform hela processen från ett patient prov fram till plasmid transfektion i däggdjurs-celllinje". 

mag1 skrev:

 

Qetsiyah skrev:

Då kan jag svara på första frågan här:

Flr det första tycker jag att frågan är konstig för att vektor betyder grejen du använder för att föra över till värdcellen (däggdjurscellerna), i detta fall har du valt att göra det halvnaket dvs med en plasmid.

Jag förstår inte ditt andra steg. Hur ska du splica DNA? Splicing är något man gör på pre-mRNA. Vill du splica DNA?? I tredje steget säger du att du vill översätta RNA till DNA, men du har redan DNA. Det hade varit enklare om du som första steg extraherade total-RNA.

Smart att sätta in flourescensgen innan transfektion! 

Tror det var tänkt att stå "RNA-extraktion" i början. Och som du skrev vore det bättre att extrahera mRNA istället - vilket är det som brukar användas som RCR-templat för att skapa cDNA av processade (bl.a.) intronfria RNA-transkript.

 

För delarna under 1. så är det knepigt att veta hur mycket som saknas, då det är väldigt sammanfattat.  För "Tekniker, huvudreagenser/komponenter", finns det massor att skriva om.

Patientprovet kanske kan beskrivas lite mer, vilken vävnad föreslår du att det tas det ifrån och hur?

Som din vektor är beskriven kommer den inte kunna ärvas vidare till de delande cellerna, d.v.s dottercellerna kommer inte ha vektorn - något saknas, kommer du på vad?

Hur skall du verifiera att din kloning (som det heter när DNA "sätts in" i t.ex. en plasmid) faktiskt fungerat?

Hur skall du verifiera att din transfektion faktiskt fungerat?

 

Loket skrev:

"Plasmiden förs in i däggdjuret med hjälp av electroporation."

Nej det går inte att transformera hela djuret, utan vad transformeras?

Förstår det, tänkte att huvudanledningen till att jag ska komplettera är att jag skrivit fel processer eller fel ordning. Kan skriva ut mer utförligt om du vill :). Tänkte inte ens på att utveckla patientprovet-processen i min ordinarie text så det ska jag skriva om nu, tack! 

Det enda jag kan komma på är att plasmiden behöver promotorregion, origin of replication, så att generna kan transkriberas. Är jag på rätt spår? Fanns en bild med på en plasmid i uppgiften, med t-overhang, ori, poly-a, amp (vet inte vad det står för) enhancer och sen markeringar för olika restriction sites. När jag tänker efter nu kanske jag behöver specifiera vilket restriktionsenzym som behövs, för det har jag inte gjort i min text. Tänkte att det kanske inte var relevant så länge det lämnade sticky ends. 

Jag valde fluoroscens som selektionsmarkör och tänkte att det skulle kunna visa vilka plasmider som tagit upp genen. Dock vet jag inte hur det ska hjälpa i värddjuret såvida det inte transfekteras in i en genomskinlig fisk (typ zebrafisk), frågan är dock ställd så att det ska transfekteras in i ett däggdjur. Antibiotika är ju också en annan markör men tänkte att det är mest behjälpligt när plasmiden är i en patogen cell/ prokaryot. Skulle nog behöva lite vägledning i den frågan. 

Genen ska ju in i själva djurcellerna men vet inte riktigt hur. Hittade inte det jag behövde i min kurslitteratur. Hittade att electroporation och microinjection är vanliga metoder för att introducera nytt dna i djurceller. Tänker jag rätt? Visste inte vilken metod som är bäst lämpad i detta fall. Misstänker att jag hoppade lite i stegen i min ordinarie text men hade svårt att förstå vilka steg som var "rätt" efter att genen ligerats in i plasmiden. 

Loket skrev:

Förstår det, tänkte att huvudanledningen till att jag ska komplettera är att jag skrivit fel processer eller fel ordning. Kan skriva ut mer utförligt om du vill :). Tänkte inte ens på att utveckla patientprovet-processen i min ordinarie text så det ska jag skriva om nu, tack! 

Det enda jag kan komma på är att plasmiden behöver promotorregion, origin of replication, så att generna kan transkriberas. Är jag på rätt spår? Fanns en bild med på en plasmid i uppgiften, med t-overhang, ori, poly-a, amp (vet inte vad det står för) enhancer och sen markeringar för olika restriction sites. När jag tänker efter nu kanske jag behöver specifiera vilket restriktionsenzym som behövs, för det har jag inte gjort i min text. Tänkte att det kanske inte var relevant så länge det lämnade sticky ends. 

Finessen med sticky-ends är att de överhängen blir specifika, så om samma restriktionsenzym används för att klyva både ditt insert (cDNA) och vektorn kommer de klyvda bitarna ha komplementära sticky ends. Använder du dessutom en kombination av två olika restriktionsenzym kan ditt klyvda cDNA bara kombineras med din vektor på ett vis (annars kan t.ex. fler än en kopia av cDNA-biten stoppas in, eller t.o.m. i inverterad riktning).

Efter klyvningen av dina DNA-bitar - hur skall du få dem att sitta ihop i en helhet? Hur planerar du att selektera fram en vektortyp med din önskade kombination, d.v.s. en plasmid som innehåller rätt cDNA-insert? Ofta görs detta m.h.a. t.ex. transformering av E. coli, som dessutom möjliggör att du kan duplicera plasmiden - för du kommer behöva massor av plasmidkopior för att ha en chans att transfektera däggdurscellinjen.

Amp, eller Amp^R anger att vektorn har en resistensgen mot detta antibiotika, vilket underlättar vid selektionen av bakterieceller som tagit upp plasmiden.

Det var mest ORI som jag fiskade efter, baserat på vad du skrev att frågan var.

 

 

Jag valde fluoroscens som selektionsmarkör och tänkte att det skulle kunna visa vilka plasmider som tagit upp genen. Dock vet jag inte hur det ska hjälpa i värddjuret såvida det inte transfekteras in i en genomskinlig fisk (typ zebrafisk), frågan är dock ställd så att det ska transfekteras in i ett däggdjur. Antibiotika är ju också en annan markör men tänkte att det är mest behjälpligt när plasmiden är i en patogen cell/ prokaryot. Skulle nog behöva lite vägledning i den frågan. 

Fluoroscensen ser du först när det fluoroscerande proteinet är bildat, så i ditt fall kan det betraktas som bonus men inte behövt för att besvara frågan - den gäller kloningen av DNA inte bildande av proteinet som genen kodar för.

Antibiotikaresistens utnyttjas ofta, f.f.a. för arbete i bakterier.

Genen ska ju in i själva djurcellerna men vet inte riktigt hur. Hittade inte det jag behövde i min kurslitteratur. Hittade att electroporation och microinjection är vanliga metoder för att introducera nytt dna i djurceller. Tänker jag rätt? Visste inte vilken metod som är bäst lämpad i detta fall. Misstänker att jag hoppade lite i stegen i min ordinarie text men hade svårt att förstå vilka steg som var "rätt" efter att genen ligerats in i plasmiden. 

Elektroporering fungerar bra för transfektion av djurceller, annars kan transfektionsreagenser användas för att rent kemiskt få din vektor att interagera med cellens membran och sedan föras in i cellen.

Om du planerar allt rätt och allt görs korrekt, så borde ditt resultat också bli korrekt, men hur verifierar du att den vektor du skapat faktiskt har rätt DNA i sig och på så vis får reda på att du lyckats?

mag1 skrev:

Loket skrev:

Förstår det, tänkte att huvudanledningen till att jag ska komplettera är att jag skrivit fel processer eller fel ordning. Kan skriva ut mer utförligt om du vill :). Tänkte inte ens på att utveckla patientprovet-processen i min ordinarie text så det ska jag skriva om nu, tack! 

Det enda jag kan komma på är att plasmiden behöver promotorregion, origin of replication, så att generna kan transkriberas. Är jag på rätt spår? Fanns en bild med på en plasmid i uppgiften, med t-overhang, ori, poly-a, amp (vet inte vad det står för) enhancer och sen markeringar för olika restriction sites. När jag tänker efter nu kanske jag behöver specifiera vilket restriktionsenzym som behövs, för det har jag inte gjort i min text. Tänkte att det kanske inte var relevant så länge det lämnade sticky ends. 

Finessen med sticky-ends är att de överhängen blir specifika, så om samma restriktionsenzym används för att klyva både ditt insert (cDNA) och vektorn kommer de klyvda bitarna ha komplementära sticky ends. Använder du dessutom en kombination av två olika restriktionsenzym kan ditt klyvda cDNA bara kombineras med din vektor på ett vis (annars kan t.ex. fler än en kopia av cDNA-biten stoppas in, eller t.o.m. i inverterad riktning).

Jag förstår. 

Efter klyvningen av dina DNA-bitar - hur skall du få dem att sitta ihop i en helhet? Hur planerar du att selektera fram en vektortyp med din önskade kombination, d.v.s. en plasmid som innehåller rätt cDNA-insert? Ofta görs detta m.h.a. t.ex. transformering av E. coli, som dessutom möjliggör att du kan duplicera plasmiden - för du kommer behöva massor av plasmidkopior för att ha en chans att transfektera däggdurscellinjen.

 

Ligas? Om du menar efter introner klipps bort. På bilden vi fick så verkar det som om plasmiden redan är förutbestämd så jag förutsatte att den är lämpad för uppgiften men kanske stod något på den som var viktigt för uppgiften.
Läste om det förut men skrev inte det i texten för förstod inte om man inkorporerade e.coli bakterierna i värddjuret sen. Att låta e.coli duplicera plasmiderna förstår jag är väldigt enkelt men det var liksom steget efter det som jag inte förstod. Tänker att e.coli är patogen (för det mesta), ska man då inkorporera det nya dnat i typ magen på djuret eftersom att där är den till nytta?  

Amp, eller Amp^R anger att vektorn har en resistensgen mot detta antibiotika, vilket underlättar vid selektionen av bakterieceller som tagit upp plasmiden.

Okej men då kan jag alltså ta bort fluoroscens-markören eftersom att det redan finns på vektorn sedan tidigare.

Det var mest ORI som jag fiskade efter, baserat på vad du skrev att frågan var.

 

 

Jag valde fluoroscens som selektionsmarkör och tänkte att det skulle kunna visa vilka plasmider som tagit upp genen. Dock vet jag inte hur det ska hjälpa i värddjuret såvida det inte transfekteras in i en genomskinlig fisk (typ zebrafisk), frågan är dock ställd så att det ska transfekteras in i ett däggdjur. Antibiotika är ju också en annan markör men tänkte att det är mest behjälpligt när plasmiden är i en patogen cell/ prokaryot. Skulle nog behöva lite vägledning i den frågan. 

Fluoroscensen ser du först när det fluoroscerande proteinet är bildat, så i ditt fall kan det betraktas som bonus men inte behövt för att besvara frågan - den gäller kloningen av DNA inte bildande av proteinet som genen kodar för. 

Antibiotikaresistens utnyttjas ofta, f.f.a. för arbete i bakterier.

Genen ska ju in i själva djurcellerna men vet inte riktigt hur. Hittade inte det jag behövde i min kurslitteratur. Hittade att electroporation och microinjection är vanliga metoder för att introducera nytt dna i djurceller. Tänker jag rätt? Visste inte vilken metod som är bäst lämpad i detta fall. Misstänker att jag hoppade lite i stegen i min ordinarie text men hade svårt att förstå vilka steg som var "rätt" efter att genen ligerats in i plasmiden. 

Elektroporering fungerar bra för transfektion av djurceller, annars kan transfektionsreagenser användas för att rent kemiskt få din vektor att interagera med cellens membran och sedan föras in i cellen.

 

Om du planerar allt rätt och allt görs korrekt, så borde ditt resultat också bli korrekt, men hur verifierar du att den vektor du skapat faktiskt har rätt DNA i sig och på så vis får reda på att du lyckats?

Det är det jag fortfarande inte listat ut men eftersom att i uppgiften är det en mutation så borde man ju kunna ta ett cellprov igen och analysera de olika generna? Eller om genen kodar för ett protein som ger synliga skillnader på individer med/utan mutation så är det ett sätt tänker jag, känns inte som den rimligaste lösningen i detta fall. I uppgiften är det en missensmutation som ska studeras (och därför klonas in i en cellinje) vilket innebär att man då borde kunna jämföra blodprov med det som togs från patienten? 

Det är det jag fortfarande inte listat ut men eftersom att i uppgiften är det en mutation så borde man ju kunna ta ett cellprov igen och analysera de olika generna? Eller om genen kodar för ett protein som ger synliga skillnader på individer med/utan mutation så är det ett sätt tänker jag, känns inte som den rimligaste lösningen i detta fall. I uppgiften är det en missensmutation som ska studeras (och därför klonas in i en cellinje) vilket innebär att man då borde kunna jämföra blodprov med det som togs från patienten?

Det verkar som om du blandar ihop begreppen lite.

I uppgiften var det frågan om en muterad form av en gen som kodar för ett protein, så kloningen behöver bara göras en gång - m.a.o. en gång per gen.

När något klonas skall bitar av olika DNA-fragment kombineras, t.ex. som i din uppgift där ett processat mRNA (utan introner etcetera) används för att bilda DNA. Denna DNA bit skall sedan sättas ihop i en vektor. I alla de steg som sker under kloningen mutationer ske (ingen biologisk process är helt perfekt), men framför allt kan det under designen av experimentet skett något fel/misstag (t.ex. en primer till PCR-reaktionen designades lite fel).

Så för att försäkra dig om att den bildade vektorn innehåller din klonade gen och att plasmiden ser ut som du planerat - behöver du läsa av DNA-sekvensen för den klonade genen samt en del av vektorn. Annars kan t.ex. en frameshift mutation. Så hur kan du läsa av DNA-sekvensen i din bildade vektor och verifiera att ditt kloningsexperiment lyckats?

mag1 skrev:

Det är det jag fortfarande inte listat ut men eftersom att i uppgiften är det en mutation så borde man ju kunna ta ett cellprov igen och analysera de olika generna? Eller om genen kodar för ett protein som ger synliga skillnader på individer med/utan mutation så är det ett sätt tänker jag, känns inte som den rimligaste lösningen i detta fall. I uppgiften är det en missensmutation som ska studeras (och därför klonas in i en cellinje) vilket innebär att man då borde kunna jämföra blodprov med det som togs från patienten?

Det verkar som om du blandar ihop begreppen lite.

I uppgiften var det frågan om en muterad form av en gen som kodar för ett protein, så kloningen behöver bara göras en gång - m.a.o. en gång per gen.

Det var så jag tolkade frågan. Kanske blandade ihop begreppen? Menade att man kunde jämföra patientprovet med ett prov från nya cellinjen. 

När något klonas skall bitar av olika DNA-fragment kombineras, t.ex. som i din uppgift där ett processat mRNA (utan introner etcetera) används för att bilda DNA. Denna DNA bit skall sedan sättas ihop i en vektor. I alla de steg som sker under kloningen mutationer ske (ingen biologisk process är helt perfekt), men framför allt kan det under designen av experimentet skett något fel/misstag (t.ex. en primer till PCR-reaktionen designades lite fel).

Så för att försäkra dig om att den bildade vektorn innehåller din klonade gen och att plasmiden ser ut som du planerat - behöver du läsa av DNA-sekvensen för den klonade genen samt en del av vektorn. Annars kan t.ex. en frameshift mutation. Så hur kan du läsa av DNA-sekvensen i din bildade vektor och verifiera att ditt kloningsexperiment lyckats?

En sekvenseringsmetod? Som Sanger?

Precis, du du behöver sekvensera din skapade vektor för att verifiera att det som du faktiskt klonat är korrekt (så du faktiskt har ditt önskade DNA med mutationen i vektorn och inget annat), samt att kloningen skett på korrekt sätt (inga frame-shifts etcerera).