Bridge amplification
Jag har lite svårt att förstå hur bridge amplification kan fungera. Detta är min förklaring hittills:
A method to create clusters of fragments in each flow cell, preparing for e.g. Illumina sequencing.
Fragments have adaptors on both ends and attach to one of the complementary oligos in the flow cell (A) and DNA polymerase moves along a strand of DNA, creating its complementary strand (B). The original strand is washed away, leaving only the reverse strand (C). At the top of the reverse strand there is an adapter sequence that attaches to the oligo that is complementary (D). Polymerase attaches to the reverse strand, and its complementary strand (which is identical to the original) is made (E). The now double stranded DNA is denatured so that each strand can separately attach to an oligonucleotide sequence anchored to the flow cell (F).
Mestadelen av förklaringen kommer från Wikipedia, men jag känner ändå att det nästan klickar. Min fråga är: hur fungerar det med två olika segment (forward och reverse) i en och samma flow cell? Då får man väl två signaler från samma cell när nukleotiderna fäster? Hur tolkar man det? Varför vill man ens ha både forward och reverse, är det för att bli säkrare på att sekvenseringen är korrekt?
fner skrev:Jag har lite svårt att förstå hur bridge amplification kan fungera. Detta är min förklaring hittills:
A method to create clusters of fragments in each flow cell, preparing for e.g. Illumina sequencing.
Fragments have adaptors on both ends and attach to one of the complementary oligos in the flow cell (A) and DNA polymerase moves along a strand of DNA, creating its complementary strand (B). The original strand is washed away, leaving only the reverse strand (C). At the top of the reverse strand there is an adapter sequence that attaches to the oligo that is complementary (D). Polymerase attaches to the reverse strand, and its complementary strand (which is identical to the original) is made (E). The now double stranded DNA is denatured so that each strand can separately attach to an oligonucleotide sequence anchored to the flow cell (F).
Mestadelen av förklaringen kommer från Wikipedia, men jag känner ändå att det nästan klickar. Min fråga är: hur fungerar det med två olika segment (forward och reverse) i en och samma flow cell? Då får man väl två signaler från samma cell när nukleotiderna fäster? Hur tolkar man det? Varför vill man ens ha både forward och reverse, är det för att bli säkrare på att sekvenseringen är korrekt?
Bilden visar endast steget där ett kluster av DNA sekvenser genereras på chippet. Sekvenseringen sker sedan från de skapade klustren (mostvarande ssDNA i F), men detta sker i en separat steg med fluoroscerande nukleotider, som i sin tur avläses individuellt - så att sekvenseringen kan ske från massvis av ssDNA strängar parallellt.
Illumina är en av de största tillverkarna av utrustning för denna typ av sekvensering, och har garanterat beskrivningar av "så här fungerar vår produkt" .
Det jag inte insåg innan var att alla reverse strands klyvs så att endast forward strands är kvar i cellen. Då förstår jag hur detta kan fungera som en metod att skapa kluster med likadana fragment som ska sekvenseras.
