Biokemi, enzymkinetik: labbplanering med givna reagens, undersökning av G6P isomeras
Hej, vi ska undersöka kinetiken hos G6P-isomeras, till vår hjälp har vi:
- 20 ml Tris buffer, pH 8.0, 50 mM
- 2 ml D-Fructose-6-phosphate, 40 mM
- 2 ml NADP+, 10 mM
- 750 µl D-Sorbitol-6-phosphate, 4.0 mM
- 2 ml Glucose-6-phosphate dehydrogenase, 20 U ml-1
- 1,5 ml Glucose-6-phosphate isomerase, 20 U ml-1, 50 µg ml-1
- HCl, 1.0 M (wear gloves and goggles)
- NaOH, 1.0 M (wear gloves and goggles)
Så jag antar att vi ska ha en kopplad reaktion vars produkt är detekterbart i spektrofotometer, samt att enzymet samt den andra reaktanten som katalyserar detta ska finnas i överskott. Alltså: något enzym tar F6P som substrat och producerar något spektrofotometerdetekterbart.
Men det verkar inte alls så enkelt. Det andra enzymet vi har fått, G6P dehydrogenas använder G6P som substrat och omvandlar det till något irrelevant, nämligen sorbitol-6-P.
Vi får också F6P samt sorbitol-6-P, dessa är uppenbarligen produkterna till de två enzymerna vi fått, hur hjälper det??
Ja eftersom NADP+ är med i materiallistan, och reduktionen av NAD(P)+ är enkel att kvantifiera med spektrofotometer, så används detta förmodligen för att följa en eller båda enzymatiska reaktionerna.
Så vilket av enzymerna använder denna kofaktor?
Och vad tror du att ni kommer använda sorbitol-6-P till?
Det andra enzymet vi har fått, G6P dehydrogenas använder G6P som substrat och omvandlar det till något irrelevant, nämligen sorbitol-6-P.
Nej detta stämmer inte, produkten är något annan. Vi saknar (om jag inte missminner mig) helt enzymer för att bilda sorbitol, men har enzym för att omvandla sorbitol från födan.
Tack! Frågan är löst!
Jag insåg inte att jag kunde använda F6P som substrat, jag ignorerade det faktum att reaktionerna kunde gå baklänges, så dumt.
Jag kanske återkommer med fler frågor, denna labb har nämligen en andra del som handlar om inhibitorer som jag inte börjat planera än.
