Beräkning av bakterier, viable count?
Jag har gjort en transformationslabb där jag har gjort E. coli resistenta mot ampicillin och nu ska jag räkna lite på det som har gjorts.
En fråga som ska besvaras är;
"Beräkna hur stor andel av de kompetenta cellerna som blivit transformerade."
De kompetenta cellerna är alltså levande E. coli som jag har tillsatt i tre olika rör, varav ett av rören är helt utan plasmid DNA.
Efter odling av dessa fick jag det till 2340 st kolonier på den plattan med högst spädning (1:1000).
Tror ni att jag kan använda viable count för denna uträkning, trots att spanat helst ska vara 20-200 kolonier när man använder den formeln?
Eller kan det vara så enkelt att jag gör så här:
Andelen transformerade = (Antal som överlever på amp-plattan) / (Antal som hade växt utan amp)
Dock känns det som att jag måste räkna ut CFU/ är för stamlösningen utan plasmid DNA för att kunna få fram rätt?
evajosefin skrev:Andelen transformerade = (Antal som överlever på amp-plattan) / (Antal som hade växt utan amp)
Du är lite otydlig med vad du har gjort, men jag tror du tänker rätt i citatet ovan.
Du är nog ute efter total viable count, som går att använda för mikroorganismer som E. coli. Viable count utnyttjar t.ex. trypan blue, som selektivt färgar döda celler och på så vis gör det möjligt att se hur många celler som är levande (viable på engelska).
Andelen av celler som transformeras får du av kvoten du beskrev, men du behöver eventuellt kompensera för volymen av cellkultur du plattade ut. Om du plattade ut samma kända volym av cellsuspension på samtliga plattor (vid 1:1000 och de andra spädningarna) kan du räkna ut antalet CFU/μl för respektive platta (+/- ampicillin).
Dock är det svårt att få en bra uppskattning av antalet celler om det ger så många celler på plattan som dina 2340, detta då det helt enkelt är svårt att dels sprida ut cellerna väl (så de inte ligger vid/på varandra) och det är knepigt att räkna - även vid segmentering av plattan i "representative tårtbitar".
Hade du 2340 på din platta utan ampicllin?
Vilka var antalet kolonier på de två andra plattorna?
Vilken var den tredje plattan, du har nämnt en med och en utan ampicillin?
