b-galaktosidas i E-Coli

kebify skrev:

Hej, gjorde en labb där vi undersökte hur genexpression i prokaryota celler kan induceras. Som inducer använde vi laktos samt I PTG. I mina resultat var enzymkoncentrationen som mest då laktos användes och som näst mest då IPTG användes. 

IPTG är ju en molekylärt analog för allolaktos förutom att den binder till repressorn kemiskt med sulfaten vilket gör att cellen inte kan hydrolysera bindningen och därmed inte bryta ner inducern. Det gör då att IPTG kommer hela tiden finnas i samma koncentration till skillnad från laktosen. IPTG är också effektivare än laktos till att lura e coli till att laktos kommer vara energi källan vilket då leder till mindre enzymaktivitet krävs. Det är dessa faktorer jag tänker är anledningen till IPTG ger mindre enzymaktivitet än vad laktos gör, kan det vara rimliga anledningar`? vad kan mer påverkas?

Det saknas lite information för att kunna svara så detaljerat som du frågar.

Du skriver att det blir mindre enzymaktivitet - är detta ditt mått på hur hög genexpressionen var?

Vilket enzyms aktivitet var det du följde (t.ex. beta-galaktosidaset med X-gal som substrat, ett annan rekombinant protein vars expression kontrollerades av lac operonet)?

Följde ni detta enzyms aktivitet i celler, eller efter lysering/rening?

Har ni normaliserat aktiviteten (indirekt enzymkoncentrationen) mot densiteten av celler (för att veta hur många celler ni använder)?

Du skrev även:

IPTG är ju en molekylärt analog för allolaktos förutom att den binder till repressorn kemiskt med sulfaten vilket gör att cellen inte kan hydrolysera bindningen och därmed inte bryta ner inducern.

Blir lite knasig syftning med "den binder till repressorn kemiskt med sulfaten ", det är hela molekylen som är involverad i bindningen, men det låter i texten som det är just sulfatgruppen som binder.

mag1 skrev:

kebify skrev:

Hej, gjorde en labb där vi undersökte hur genexpression i prokaryota celler kan induceras. Som inducer använde vi laktos samt I PTG. I mina resultat var enzymkoncentrationen som mest då laktos användes och som näst mest då IPTG användes. 

IPTG är ju en molekylärt analog för allolaktos förutom att den binder till repressorn kemiskt med sulfaten vilket gör att cellen inte kan hydrolysera bindningen och därmed inte bryta ner inducern. Det gör då att IPTG kommer hela tiden finnas i samma koncentration till skillnad från laktosen. IPTG är också effektivare än laktos till att lura e coli till att laktos kommer vara energi källan vilket då leder till mindre enzymaktivitet krävs. Det är dessa faktorer jag tänker är anledningen till IPTG ger mindre enzymaktivitet än vad laktos gör, kan det vara rimliga anledningar`? vad kan mer påverkas?

 

Det saknas lite information för att kunna svara så detaljerat som du frågar.

Du skriver att det blir mindre enzymaktivitet - är detta ditt mått på hur hög genexpressionen var?

Vilket enzyms aktivitet var det du följde (t.ex. beta-galaktosidaset med X-gal som substrat, ett annan rekombinant protein vars expression kontrollerades av lac operonet)?

Följde ni detta enzyms aktivitet i celler, eller efter lysering/rening?

Har ni normaliserat aktiviteten (indirekt enzymkoncentrationen) mot densiteten av celler (för att veta hur många celler ni använder)?

 

Du skrev även:

IPTG är ju en molekylärt analog för allolaktos förutom att den binder till repressorn kemiskt med sulfaten vilket gör att cellen inte kan hydrolysera bindningen och därmed inte bryta ner inducern.

Blir lite knasig syftning med "den binder till repressorn kemiskt med sulfaten ", det är hela molekylen som är involverad i bindningen, men det låter i texten som det är just sulfatgruppen som binder.

Enzymkoncentationen regleras genom att cellen stoppar eller startar transkriptionen för de gener som kodar för de enzymer som behövs alltså genexpresionen  regleras efter det cellulära behovet. Koncentrationen ökar om speciella inducerande ämnen finns närvarande, här IPTG och laktos. Bakterien använder sig av adaptiv enzymsyntes gör att kunna använda laktosen och IPTG som energikälla. Det är beta-galaktosidas som bryter ner  laktos till galaktos och glukos. E-coli syntenserar nästan ingen beta-galaktosidas annars. Om då en induktor (laktos eller iptg) beta-galaktosidas är närvarande ökar enzymkoncentrationen kraftigt. För att mäta enzymaktiviteten tillsades FDG vilket gav fluorense då beta-galaktos syntenserats. Fluroensen mättes i spektroflurometer.


Syftade på att hela IPTG binder in kemiskt vilket då leder till att cellen inte kan bryta ner den och koncentrationen IPTG därför är konstant.

Hoppas det svarar på dina frågor:)

En annan anledning kanske kan ha varit koncentrationen IPTG? Det borde ju påverka mängden β-galaktosidas som bildas.

Okej då detekterade ni enzymets aktivitet, från dess bildade fluoroscerande produkt.

För att kunna jämföra expressionen (från det translaterade enzymets aktivitet, genom att mäta fluorescensen) mellan olika experiment behöver ni normalisera fluorescensen mot celldensiteten. Ni behöver ha lika många expressionsaktiva celler i alla prover, annars kan du få en högre fluorescenssignal från ett prov beroende på att det bara råkar vara mer celler där - d.v.s. inte nödvändigtvis som en effekt av högre expression.

En annan anledning kanske kan ha varit koncentrationen IPTG? Det borde ju påverka mängden β-galaktosidas som bildas.

Hur hög koncentration av IPTG hade ni i kulturmediet? 1mM?

Koncentrationen av IPTG/allolaktos påverkar, men lac operonets repressor anses inte kunna titrera, d.v.s. antingen är koncentrationen i bakteriecellen tillräckligt hög för att repressorn skall släppa och expressionen startar, eller så är den för låg för detta, mer eller mindre digitalt (på/av). Detta gäller dock per cell, så vid lägre koncentrationer av IPTG är en population aktiva och en större mängd inaktiva.

Med andra E. coli operon, t.ex. arabinos operonet, kan expressionen titreras med ökande arabinoskoncentration , och över en större koncentrationsskillnad.  

mag1 skrev:

Okej då detekterade ni enzymets aktivitet, från dess bildade fluoroscerande produkt.

 

För att kunna jämföra expressionen (från det translaterade enzymets aktivitet, genom att mäta fluorescensen) mellan olika experiment behöver ni normalisera fluorescensen mot celldensiteten. Ni behöver ha lika många expressionsaktiva celler i alla prover, annars kan du få en högre fluorescenssignal från ett prov beroende på att det bara råkar vara mer celler där - d.v.s. inte nödvändigtvis som en effekt av högre expression.

 

En annan anledning kanske kan ha varit koncentrationen IPTG? Det borde ju påverka mängden β-galaktosidas som bildas.

Hur hög koncentration av IPTG hade ni i kulturmediet? 1mM?

Koncentrationen av IPTG/allolaktos påverkar, men lac operonets repressor anses inte kunna titrera, d.v.s. antingen är koncentrationen i bakteriecellen tillräckligt hög för att repressorn skall släppa och expressionen startar, eller så är den för låg för detta, mer eller mindre digitalt (på/av). Detta gäller dock per cell, så vid lägre koncentrationer av IPTG är en population aktiva och en större mängd inaktiva.

Med andra E. coli operon, t.ex. arabinos operonet, kan expressionen titreras med ökande arabinoskoncentration , och över en större koncentrationsskillnad.  

Vi använde 0,1 M IPTG och 0,2 M laktos. 300 mikroliter för varje.

Att enzymaktiviteten skiljer sig åt mellan proverna är inte så ovanligt, det kan bero på många faktorer. Men som du skrev är IPTG en stark de-repressor, och den förväntade effekten är snarare motsatsen - att genexpressionen är högre med IPTG.

Dock är det skillnad mellan genexpression och enzymatisk aktivitet, det är ju några steg mellan.

Vi använde 0,1 M IPTG

Okej det anger hur mycket som tillsattes, men inte slutkoncentrationen (c*v=n, men sedan spädes allt igen i mediet).

Anledningen att jag tjatar om slutkoncentrationen, är att den kan vara för hög för att cellen skall klara av proteinproduktionen. Om det bildas massor av mRNA, kommer en väldigt stor andel av cellens ribosomer arbeta med just detta mRNA och bilda massor av t.ex. beta-gal. Men för att klara av vecka och kontrollera kvalitén (att de nybildade proteinerna inte t.ex. veckas fel för det går för fort) av de syntetiserade proteinerna behövs andra proteiner som hjälper till vid translationen. Koncentration av dessa hjälparproteiner ökar dock inte på samma sätt utan mängderna är anpassade till ett mer "normalt" tillstånd i cellen. När IPTG tillsätts bildas väldiga mängder av mRNA under kontroll av lac promotorn, vilket kan överväldiga cellens kapacitet att bilda detta protein på ett korrekt sätt. 

Jag tror inte detta är orsaken till er observation men är relevant vid rekombinant proteinproduktion.