Antikroppsutveckling med fagdisplay
Hej, jag förstår hur allt funkar, men bara en liten detalj oklar, sätter vi in antikroppsgenen i M13s genom? Hur?
DNA stoppas in genom t.ex. ligering. Kan till och med använda en modifierad form av M13 (kanske M13s redan är modfierad?) med ett MCS i PIII genen (eller någon av de andra "cap" proteinerna). Gärna då med MCS anpassat för att täcka/prova alla tre reading-frames, och på så vis få korrekt translaterad sekvens.
Men... hurdå? Bara ligera in den? Genomet ligger ju inuti ett virus?
Ja genomet ligger i virus när det är packat, men innan dess är det fritt i cellen. Och från både viruspartikeln (a.k.a viron) och cellen kan DNA enkelt extraheras.
Virusgenomet, eller de vektorer som används, brukar var modifierade så de har ett MCS (multiple cloning site) i DNA segmentet som kodar för det ytprotein du vill stoppa in din polypeptid i. MCS innehåller specifika sekvenser 4-8baser, (i ett s.k. restriction site) som känns igen av ett specifikt restriktionsenzym. Så med hjälp av dessa restriktionsenzym kan virus-DNAt (eller vektorn baserad på viralt-DNA) klyvas, och efter att du tillfört den DNA snutt du vill stoppa in, kan ligaset ligera ihop allt (till genomet+ditt DNA). Denna process går att planera så att det bildas komplementära "sticky ends" på både det virala DNAt och din DNA-snutt, så de basparar specifikt och ligaset skapar de saknade fosfodiesterbindingarna.
Sedan behöver den modifierade formen (till genomet+ditt DNA) transformeras in i E. coli, som används för att amplifiera DNAt och packa ihop nya viruspartiklar. Och dessa partiklar används vid phage display.
Beroende på vilket modifierat virus-genom eller vektor som används kan en hjälpar-fag behövas för att bygga upp och frisätta fagerna.
