Antikroppar för Western blot och flödescytometri
Hej, här är frågan:
För att generera antikroppar mot en receptor (VEGFR) har ni använt två olika strategier. Dels har ni tagit en 20-aminosyrors kort peptid som motsvarar en del av receptorn och använt peptiden för att generera monoklonala antikroppar med hybridoma-teknologi. Sen har ni också tagit rekombinant full-längdsreceptor (extracellulära delen) och selekterat rekombinanta monoklonala antikroppar in vitro.
- Vilken antikropp skulle ni använda i Western blotefter SDS-PAGE
- samt i flödescytometri mot levande celler (motivera era svar)?
Jag svarar att
- Den förstnämnda antikroppen binder till bara 20 peptider på receptorn, så det är mer sannolikt att den ska kunna binda trots att den är denaturerad till följd av geleketro.
- Här ska de sistnämnda antikropparna användas, för den kan binda till intakta, icke denaturerade, VEGFR receptorer.
Det anges inte till vilken epitop denna 20 aminosyrarester (aa) sekvens tillhör. Finns VEGFR epitopen utanför cellen, i membranet eller i cellens cytoplasma? Vidare vet du inte om denna sekvens kan bilda en sekundärstruktur, t.ex. betaflak, så denna är nog inget bra alternativ för FC/FACS. Men till Westernexperimentet låter det bra.
20 aa är förresten inte så "bara" utan ganska stort det finns t.ex. antikroppar som känner igen eptioper mindre än en aa.
Just därför att peptidantikroppen kan vara så pass begränsad, med bland annat denatureringen som problem så låter ditt val av denna till FC/FACS bra.
Missade ett ord där:
Just därför att peptidantikroppen kan vara så pass begränsad, med bland annat denatureringen som problem så låter ditt val av denna till FC/FACS bra.
Det menade att den monoklonala antikroppen var bra till FC/FACS just för peptidantikroppen kan vara så begränsad.
